天昊目的区域甲基化测序在不同研究领域客户文章集锦

发稿时间：2020-09-30来源：天昊生物

截止到2020年9月，
天昊MethylTarget^®技术已经完成252个项目

  对于DNA目的区域甲基化水平的检测，目前市场上有各种技术平台，但是不同技术均有各自的技术痛点，要么成本高（目的区域液相芯片捕获），要么不能准确定量研究（MSP/BSP），要么操作复杂、不具有单碱基分辨率（色谱、质谱），无法获得甲基化单倍型（焦磷酸测序）。而天昊生物的多重目的区域甲基化富集测序技术MethylTarget^®针对这些核心痛点，不但从技术策略及生信分析方面创新性地解决了上述技术难题，还有更多应用优势：

※ 性价比高：传统克隆测序一个片段10个克隆的价格，MethylTarget^®可以完成约60个片段的检测（检测深度为1000X，相当于1000个克隆）；

※ 精确度高：基于二代测序数据检测甲基化程度，精确到单碱基分辨率，与全基因组甲基化测序，RRBS数据，甲基化芯片数据有高度一致性；

※ 准确定量：测序深度高达1000X，并可以进一步加深，相比于传统克隆测序，可以对位点甲基化程度进行准确定量；

※ 技术灵活：基于多重PCR对目标区域进行富集，可随时应对基因和位点的变化和改动，并且可以获得每个片段的甲基化单倍型。

MethylTarget^®技术自服务市场以来，其准确性和性价比优势快速获得了大量课题组的认可。

优秀的技术平台结合课题组的专业研究思路，已经快速转化为一大波优质SCI文章，下面按不同研究领域分别向大家介绍：

苏州大学医学部公共卫生学院遗传流行病与基因组学研究中心雷署丰教授团队文章《外周血单个核细胞中类风湿性关节炎相关的DNA甲基化位点》发表在Annals of the Rheumatic Diseases (IF：16.102)。

作者首先利用甲基化450K芯片和LncRNA&mRNA Human Gene Expression MicroarrayV.4.0芯片对43例样本中外周血单个核细胞的基因组甲基化水平和RNA表达水平进行检测 (RA：healthy = 25：18)，然后基于甲基化数据和表达量数据进行关联分析和甲基化的因果推理测试，构建差异甲基化基因调控网络。利用天昊生物MethylTarget^®目的区域甲基化检测技术在验证阶段的样本中检测10个DMP的甲基化水平，继而对经验证的PARP9基因在Jurkat 细胞中进行相关的细胞学功能实验。

上海复旦大学生科院王久存教授课题组文章《全基因组DNA甲基化研究发现系统性硬化症患者CD4⁺和CD8⁺ T细胞的干扰素相关基因表现低甲基化状态》发表在The Journal of Investigative Dermatology (IF：7.143)。

首先利用全基因组甲基化芯片检测确定差异甲基化位点，GO富集分析发现干扰素相关通路基因在2种T细胞的DMR中都显著富集。利用天昊生物MethylTarget^®目的区域甲基化检测技术检测第一阶段的部分样本，表明450K甲基化检测芯片和目的区域甲基化技术结果的一致性非常好，Pearson相关性高达86%和90%。目的区域甲基化技术在独立的样本中验证第一阶段获得的干扰素信号通路基因（16个基因；62个位点），其中5个基因的差异甲基化得到验证。通过检测干扰素信号通路基因的表达量，部分基因的表达量与甲基化程度表现显著的负相关。通过检测血液 IFN-a、IFN-b水平，发现部分干扰素信号通路基因高表达与高IFN-a、IFN-b水平相关。

苏州大学医学院王明华教授和上海复旦大学生科院王久存教授在食管鳞状细胞癌DNA甲基化方向文章两连发，Clinical Epigenetics (IF：5.028)；Frontiers in Genetics (IF：3.258)。

TCGA数据库来源的84例ESCC肿瘤组织和16例癌旁组织甲基化检测数据作为发现阶段，来源于GEO的4例ESCC肿瘤组织和8例对照的甲基化芯片检测数据作为验证阶段，确定了5个潜在DNA甲基化biomarker，这5个区域在ESCC肿瘤组织中表现为高甲基化，且在正常人的外周血单核白细胞和外周血白细胞中表现低甲基化。依据这5个区域甲基化程度建立的预测模型，对肿瘤和癌旁具有良好的区分特性（sensitivity = 0.89, specificity = 0.81, AUC = 0.87）。在本实验收集的94对癌和癌旁组织中，采用MethylTarget^®目的区域甲基化检测技术验证甲基化程度，进一步验证了该模型的效力（实验设计流程图如下左图）。

作者同样基于文献检索和数据库信息筛选了65个候选的肿瘤抑癌基因作为潜在DNA甲基化biomarker，然后利用MethylTarget^®目的区域甲基化检测技术在94对ESCC癌和癌旁组织中对经筛选的6个基因进行甲基化水平验证，ADHFE1、EOMES、SALL1和TFPI2被验证，而且在ESCC样本中表现为显著的高甲基化。基于逻辑回归的预测模型具有中等的ESCC分类性能（sensitivity = 0.66, specificity = 0.87, AUC = 0.81）。因此这一数据表明ADHFE1、EOMES、SALL1和TFPI2的甲基化panel可能是一种有效的基于甲基化的ESCC诊断方法（实验设计流程图如下右图）。

浙江大学朱益民教授课题组和来茂德教授课题组文章发表在Epigenomics (IF：4.112)上，利用基因甲基化水平建立了一种区分正常和肿瘤组织的新型结直肠癌鉴别模型。

作者首先从文献中检索CRC相关的甲基化调控基因，基于TCGA数据库中373例样本的甲基化数据和RNA表达数据，验证候选基因启动子区域和第一外显子中CpG位点的甲基化水平，并基于LASSO算法进一步筛选候选基因和CpG位点。随后在94例中国CRC样本中进行候选基因和CpG位点验证（天昊目的区域甲基化MethylTarget^®检测方法），基于LASSO算法建立基于甲基化水平的CRC鉴别模型，并在TCGA数据和CRC患者数据中对诊断模型进行评估。

中南大学湘雅三医院胃肠外科李小荣教授课题组在Frontiers in Oncology (IF：4.848)杂志上报道了多个基因的启动子甲基化和结直肠癌临床病理特征的相关性。

作者试图在结直肠癌(CRC)数据库和他们的CRC队列的基础上找到理想的表观遗传基因参与CRC。在最新的数据库中，CRC中极高频率高甲基化的前20个基因被鉴定出来。然后利用天昊目的区域甲基化MethylTarget^®检测方法在成对的结直肠肿瘤样本、癌旁样本和四种CRC细胞系中验证HOXA5, HOXA2和HOXA6基因甲基化水平。结果表明，CRC组织和细胞在3个HOXA基因启动子区域具有更高的甲基化水平。HOXA基因的ROC曲线在区分健康个体和CRC患者组织方面表现出良好的诊断能力，特别是对于I期患者。对HOXA基因的甲基化模式与临床指标进行相关性分析，发现HOXA2甲基化与年龄、淋巴转移（N）、分期、远端转移（M）、淋巴血管侵犯、周围神经侵犯、淋巴结数目显著相关。HOXA5甲基化与年龄、T、M、分期和肿瘤状态相关，HOXA6甲基化与年龄和KRAS突变相关。

广西医科大学第一附属医院心内科尹瑞兴教授课题组在Aging (IF：4.831)杂志报道了《整合DNA甲基化和基因表达分析冠状动脉疾病的发病机制》。

作者进行了(1)外周血样本的全基因组DNA甲基化和mRNA表达谱分析，这些数据来自CAD样本和对照组的GEO数据；(2)功能富集分析和差异甲基化基因调控网络构建；(3) 11个感兴趣的差异甲基化位点及其基因表达的验证试验（天昊目的区域甲基化MethylTarget^®检测方法）；(4) DNA甲基化与mRNA表达数据的相关性分析。结果发现冠心病组中CXCL12低甲基化较少，而ITGB1、PDGFRB、PIK3R1的相对表达较低，CXCL12、ITGB1的甲基化与表达呈负相关。本研究明确了DNA甲基化与基因表达的相关性，并强调了CXCL12在CAD发病机制中的重要性。

南京大学医学院金陵医院神经内科徐格林教授课题组发现CDKN2B甲基化增加了主动脉弓钙化的风险，相关研究结果发表在J Atheroscler Thromb (IF：3.876)。

研究选择缺血性脑卒中患者322例，其中存在主动脉弓钙化患者248例，无主动脉弓钙化患者74例。利用MethylTarget^®目的区域甲基化检测技术检测患者血液样本CDKN2A/2B启动子区CpG岛甲基化水平(共36个CpG位点)。结果发现动脉钙化患者CDKN2B甲基化水平显著高于不存在钙化的缺血性脑卒中患者；CDKN2B甲基化水平与患者动脉钙化指标对数转换成正相关（矫正rs4977574的影响）。因此，CDKN2B高甲基化可能提示缺血性脑卒中患者有更高的动脉弓钙化风险。

浙江大学第一附属医院泌尿外科谢立平和刘犇团队发现CCND1, NOP14和DNMT3B参与膀胱癌中miR-502-5p介导的细胞迁移和增殖抑制，论文发表在Cell Proliferation (IF：5.753)。
MiR-502-5p在膀胱癌中经常下调，同时CpG岛的高甲基化（目的区域甲基化MethylTarget^®检测方法）导致miR-502-5p的下调。在功能上，过表达miR-502-5p在体外抑制细胞增殖和迁移，在体内抑制肿瘤生长。CCND1、DNMT3B和NOP14被鉴定为miR-502-5p的直接靶点。有趣的是，DNMT3B和miR-502-5p在膀胱癌调控中建立了正反馈回路。此外，rescue实验进一步验证了miR-502-5p与其靶点之间的直接分子相互作用。这项研究提出并证明了miR-502-5p介导的调控网络在膀胱癌中至关重要。

浙江大学第一附属医院肝胆胰外科郑树森院士团队和张微教授团队发现SOCS1通过降低细胞核中CyclinD1/CDK4复合物的稳定性来阻断肝细胞癌中G1-S期过渡，论文发表在Aging (IF：4.831)。

CDK蛋白家族的抑制剂已被批准用于多种肿瘤的治疗。然而，开发新药物联合CDK抑制剂有望提高治疗效果。作者鉴定了细胞因子信号通路1 (SOCS1)抑制因子在肝细胞癌(HCC)细胞模型和异种移植小鼠模型中的作用。多个HCC细胞中SOCS1的甲基化水平显著增加（目的区域甲基化MethylTarget^®检测方法），导致其表达水平下降。当人为上调SOCS1表达时，HCC细胞系在细胞周期G1-S过渡时被阻滞。有趣的是，在此过程中，CyclinD1总蛋白增加，但有效比例下降。进而发现CyclinD1在细胞核中的缺失可能是由于P21的基于泛素降解导致细胞核CyclinD1的稳定性下降，从而抑制了细胞周期向S期的发展。当P21表达增加后，抑制CyclinD1活性的成分水平如预期的一样下降，说明P21对肿瘤有部分促进作用。SOCS1是预后、肿瘤大小和术后长期生存的良好指标。SOCS1有望与CDK家族抑制剂联合成为药物靶点。

湖南师范大学医学院李健老师课题组发现父方孕前不良饮食习惯对女性后代的代谢损伤影响可被雌性大鼠孕期叶酸治疗过程逆转，Diabetologia (IF：7.518)。

作者发现对于父方高脂-糖-盐饮食组，其雌性后代表现明显的葡萄糖耐受损伤，可能是肝组织一些关键代谢基因表达异常的外在体现。对于父方高脂-糖-盐饮食组，其后代表现整体甲基化上升，但一些代谢核心基因的甲基化水平并无显著变化（目的区域甲基化MethylTarget^®检测方法）。雄性大鼠孕前不良饮食习惯对女性后代的代谢损伤影响可被雌性大鼠孕期叶酸治疗过程逆转。因此该研究提示母亲孕期服用叶酸，可能能够改善和治疗父方孕前快餐饮食习惯对子代造成的表观遗传学不良影响。

浙江中医药大学江阿沛教授课题组发现DNA甲基化参与了治疗雌性系统性红斑狼疮小鼠白芍总苷调控ERα，Journal of Pharmacological Sciences (IF：2.835)。

白芍总苷(TGP)是从白芍根部提取的生物活性化合物，已用于治疗自身免疫性疾病。但TGP在自身免疫性疾病治疗中的分子机制尚不清楚。ERα在SLE疾病中有促炎作用。在本研究中，作者发现TGP通过上调ERα启动子甲基化水平（目的区域甲基化MethylTarget^®检测方法），显著降低了ERα的表达。进一步的研究表明，TGP治疗可以增加狼疮小鼠DNMT的表达。另外还使用了DNA甲基转移酶抑制剂来验证DNA甲基化是否参与了这些过程。HE染色结果显示，TGP可减轻SLE小鼠肾损伤。TGP可抑制血清中IFN-g、IL6、IL12等细胞因子的表达及dsDNA水平。这些发现表明，TGP在SLE小鼠中抑制自身免疫可能是通过下调ERα的表达，而这可能是由于其能够调节ERα启动子的甲基化状态。

南京农业大学动物生理生化重点实验室赵茹茜教授课题组于2017年12月在《Poultry Science》杂志（IF：2.659）上发表了补充甜菜碱促进蛋鸡类固醇激素合成急性调节蛋白和卵黄沉积肾上腺皮质酮表达的文章，在这项研究中使用了目的区域甲基化MethylTarget^®检测方法。

课题组利用MethylTarget^®技术同年又在《Comparative Biochemistry and Physiology》杂志（IF：2.219）杂志上发表了母鸡补充甜菜碱通过DNA甲基化修饰来调控F1代公鸡下丘脑胆固醇代谢相关基因表达的文章。

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