Science重磅：肠道细菌可以提高肿瘤免疫治疗效果

发稿时间：2020-09-30来源：天昊生物

英文题目: Microbiome-derived inosine modulates response to checkpoint inhibitor immunotherapy

中文题目：微生物源性肌苷调节检查点抑制剂免疫治疗的响应

期刊名：Science

发表时间：2020年8月13日

单位: 加拿大卡尔加里大学卡明医学院斯奈德慢性病研究所生理学与药理学系

  有几种肠道细菌与免疫检查点阻断（ICB）疗法的增强效果有关，但微生物组增强抗肿瘤免疫的潜在机制尚不清楚。在这里，我们分离出三种细菌，包括Bifidobacterium pseudolongum （假长双歧杆菌）,  Lactobacillus johnsonii（约氏乳杆菌）和Olsenella（龈乳杆菌），它们在四种小鼠癌症模型中显著地增强了免疫检查点抑制剂（例如CTLA-4和PD-1）的功效。我们发现Bifidobacterium pseudolongum通过产生代谢物肌苷（inosine）来增强的免疫治疗疗效。免疫治疗引起的肠道屏障功能下降增加了肌苷的全身系统转运和抗肿瘤T细胞的活化。肌苷的作用依赖于T细胞表达的腺苷受体A_2AR，并需要共刺激（例如CTLA-4抗体和CpG的共刺激）。总之，我们的研究确定了一种新的微生物代谢物免疫途径，它被免疫疗法激活，可用于开发基于微生物的辅助疗法。

  免疫检查点阻断（ICB）疗法（免疫检查点是通过调节免疫反应来维持自身耐受并保护周围组织的免疫抑制性通路，肿瘤细胞利用这一特性逃避免疫细胞的攻击。目前研究最广泛的两个免疫检查靶点即细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA-4)和PD-1受体。免疫检查点抑制剂通过抑制免疫检查点活性，释放肿瘤微环境中的免疫刹车，重新激活T细胞对肿瘤的免疫应答效应，从而达到抗肿瘤的作用）可以利用免疫系统的治疗潜力，对某些肿瘤和某些癌症患者是一种有效的治疗方法。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4），程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）或其配体（PD-L1）靶向药已经彻底改变了一些癌症的治疗，包括黑色素瘤、肾细胞癌和非小细胞肺癌。然而，许多其他癌症显示出对ICB治疗的原发性抗药性，并且免疫治疗应答率仍然很低，甚至ICB治疗有效的那些癌症患者之间也存在差异，因此，迫切需要确定这种免疫治疗不应答的根本原因。最近的研究提供了强有力的证据表明肠道微生物群可以影响抗肿瘤免疫，肠道微生物群的组成甚至可以预测ICB治疗的疗效。一系列开创性的研究表明，ICB疗法的疗效取决于特定的肠道细菌，使用促进ICB菌治疗可能有助于克服ICB治疗的原发性耐药性。尽管发现特定的细菌种类与增强抗肿瘤免疫有关，但这些微生物增强ICB治疗的确切分子机制仍然不清楚。在这项研究中，我们利用大肠癌（CRC）的动物模型来识别特定的促进ICB疗效的细菌，阐明这些微生物如何提高ICB治疗效果的潜在分子机制，并在膀胱癌和黑色素瘤模型中验证了我们的发现。

  虽然肠道微生物群可以影响大肠癌的进展，并可能改变化疗的疗效，但临床上，ICB治疗在大多数大肠癌病例中是众所周知无效的，而且微生物群在无响应中的作用尚未确定。因此，我们研究了ICB疗法在小鼠模型中的疗效，该模型使用偶氮甲烷（AOM）和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导结肠肿瘤（图1A）。值得注意的是，用CTLA-4抗体或PD-L1抗体治疗可导致肿瘤明显减少和变小（图1B和C），并降低肿瘤中上皮细胞干细胞标志物EpCam⁺Lgr⁵⁺的细胞频率（图1D）。CTLA-4抗体治疗还导致免疫细胞浸润到肿瘤中（图1E）。还观察到肿瘤引流淋巴结中的CD8⁺T细胞频率增加（图S1A），脾脏中IFNγ⁺CD4⁺和IFNγ⁺CD8⁺T细胞增加（图S1、B和C）。在此模型中，当使用相同的抗体剂量时，CTLA-4抗体治疗的作用要大于PD-L1抗体治疗的作用。在这个模型中，CTLA-4和PD-L1抗体治疗疗效的差异可能取决于剂量-效应关系，先前已针对PD1治疗描述了更高的剂量。此外，CTLA-4和PD1/PD-L1抗体治疗的效应器功能依赖于不同的机制，其中调节性T细胞和Treg的组成和功能在不同的癌症类型和肠道肿瘤中都是不同的。 

  接下来，我们使用这个模型系统来筛选与ICB反应相关的潜在有益细菌。虽然ICB治疗组和对照组小鼠的粪便细菌组成（β-多样性）没有明显变化（图S1D），但少数细菌丰度却有差异（图S1E）。相比之下，肿瘤部位相关细菌群落的测序揭示了ICB治疗组和对照组小鼠在β多样性有差异（图S1F），并且在ICB治疗组的肿瘤中，一些额外的细菌丰度与对照组相比存在差异（图1F和图S1，G和H）。因此，我们对两组的均质化肿瘤进行厌氧培养，能够培养和鉴定出21个不同的细菌菌株：7种细菌仅从ICB治疗组的肿瘤中培养得到，而4种细菌仅存在于对照组中（图1G）。值得注意的是，Bifidobacterium pseudolongum（B. pseudolongum）（假长双歧杆菌）是仅从ICB治疗组的肿瘤中培养出来的菌株之一，Bifidobacterium pseudolongum属于Bifidobacterium（双歧杆菌属），经测序鉴定其丰度存在差异（图1F和图S1、G和H）。有趣的是， Akkermansia muciniphila（A. muciniphila）最近被证实能增强PD-L1和PD-1抗体治疗肺癌和肾癌的疗效，它也是仅从ICB治疗组的肿瘤中培养出来的七种细菌之一（图1G）。分离和鉴定与ICB治疗响应相关的不同细菌为我们提供了一个机会来确定所涉及的分子机制。

  接下来，我们确定ICB治疗大肠癌的疗效是否依赖于微生物群。由于微生物群有限的动物体内原位腺癌的发生率严重降低，我们转而采用异位体内结直肠癌模型，将MC38结直肠癌细胞植入无菌（GF）或无特异性病原体（SPF）小鼠的侧腹，一旦肿瘤可触知，随后进行ICB治疗（图S2A）。与GF小鼠相比，抗CTLA-4治疗导致肿瘤更小（图S2B），并显著增加SPF中肿瘤内和脾脏CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖（图S2，C到F）。与GF小鼠相比，在SPF小鼠CTLA-4抗体治疗导致肿瘤更小（图S2B），并显著增加肿瘤内和脾脏CD4⁺和CD8⁺T细胞的活化和增殖（图S2，C到F）。为了确保ICB疗效的丧失不仅仅是GF小鼠不成熟免疫系统的反映，我们还评估了ICB治疗在抗生素处理过的SPF小鼠中的效果（图S2G），发现与GF小鼠相似，广谱抗生素也降低了荷瘤SPF小鼠的ICB治疗效果（图S2，H至J），这说明某些微生物的存在能够提高免疫治疗的效果。

  为了评估在ICB治疗小鼠肿瘤中富集的分离细菌（图1G）是否能够提高ICB治疗的疗效，我们将五种不同的分离细菌转移到GF小鼠中，然后制造出了只有一种细菌定植的小鼠。将MC38肿瘤细胞异位注射到单菌定植的小鼠或GF小鼠中，在可触见肿瘤发生后，对所有小鼠进行CTLA-4抗体治疗，并评估肿瘤生长和抗肿瘤免疫（图1H）。在所测试的五种细菌中，与GF小鼠或Colidextribacter和Prevotella单菌定植小鼠相比，B. pseudolongum, Lactobacillus johnsonii (L. johnsonii) （约氏乳杆菌）和Olsenella（龈乳杆菌）单菌定植小鼠显著提高了CTLA-4抗体治疗的效力（图1I和J，图S3A和B）。此外，在B. pseudolongum, Lactobacillus johnsonii和Olsenella单菌定植小鼠肿瘤中，CD4⁺和CD8⁺T细胞活化显著增加（图1K），而肿瘤内CD8⁺T细胞（图S3C和D）的增殖略有增加。与Colidextribacter对照菌相比，分离的促进ICB疗效的B. pseudolongum也提高了MC38异位肿瘤小鼠模型中PD-L1抗体治疗的疗效（图S4），尽管疗效程度低于CTLA-4抗体治疗（相同剂量）的观察结果，类似于我们在AOM/DSS模型中的观察结果。由于B. pseudolongum对ICB治疗的促进作用最强，因此被选作进一步的机理研究。值得注意的是，其他双歧杆菌，如B. breve和B. longum，以前在小鼠黑素瘤模型中已被发现能促进抗肿瘤免疫并增强PD-L1抗体治疗的效力。在人类中，B. longum被报道富含PD1抗体的应答者。此外，B. pseudolongum广泛分布于哺乳动物肠道中，许多不同的菌株表现出基因组多样性和不同的代谢能力，表明其具有菌株依赖性功能。

  我们发现抗肿瘤免疫依赖于ICB治疗，因为在没有CTLA-4抗体治疗的情况下，B. pseudolongum单菌定植小鼠不能减少肿瘤生长（图S5A到C）或诱导抗肿瘤免疫（图S5D和E），重要的是，尽管先前的研究表明，一些细菌在肿瘤环境中积聚，在那里它们局部刺激免疫系统并通过有毒代谢物杀死肿瘤细胞，但我们无法在异位肿瘤中检测到B.pseudolongum（图S6），因此，尽管事实上最初是从肠道肿瘤中分离出B. pseudolongum，但在我们的模型中增强ICB治疗疗效并不需要肿瘤内存在B. pseudolongum，这表明可溶性因子可能参与其中。

  尽管在没有ICB治疗的情况下B. pseudolongum不能诱导抗肿瘤免疫（图S5），但B. pseudolongum在小肠固有层CD4 + T中诱导Th1主转录调节因子T-bet的表达显著增加。在GF小鼠或Colidextribacter对照菌定植小鼠中未观察到这个现象（图2A和B），这说明B. pseudolongum即使在没有ICB治疗的情况下也具有一些免疫调节能力，但是在没有ICB治疗的情况下，这种影响仅限于肠道相关淋巴组织（GALT），在脾脏中没有观察到（图2C）。在没有ICB治疗的情况下B. pseudolongum虽然可以诱导Th1主转录调节因子T-bet的表达，但是没有增加Th1细胞效应器功能的激活，因为IFN-γ⁺T-bet⁺细胞在任何被评估的组织中与对照组没有区别（图2B和C，以及图S7A）。综上，在没有肿瘤和ICB治疗的情况下，虽然B. pseudolongum促进肠道相关淋巴组织（GALT）的Th1转录分化，但是没有增加肠道和引流淋巴结的效应功能。

  由于在没有肿瘤和ICB治疗的情况下B. pseudolongum单菌定植只诱导局部粘膜Th1分化，我们接下来想知道B. pseudolongum和CTLA-4抗体治疗在没有肿瘤的情况下是否会导致全身系统性的Th1活化。事实上，与GF小鼠或Colidextribacter对照菌定植小鼠相比，B. pseudolongum单菌定植联合ICB治疗可显著增强脾脏Th1细胞活化和效应器功能，IFN-γ的产生可证明这一点（图2D和E以及图S7H和I）。综上，我们的结论是B. pseudolongum诱导Th1分化，并与CTLA-4抗体治疗一起激活Th1效应T细胞。

  我们对B. pseudolongum诱导Th1转录分化的能力和ICB治疗后Th1效应器功能激活的能力感兴趣。胃肠道炎症是CTLA-4抗体治疗常见的免疫相关不良反应，我们推断这可能是由于肠道屏障完整性的降低,事实上，与对照组相比，用CTLA-4抗体治疗的单菌定植动物表现出全身血清抗体反应增强，特别是Th1相关的IgG2b，并且小肠经皮电阻降低（图S8 A和B）。尽管如此， CTLA-4抗体治疗并没有引起明显的局部或全身炎症（图S8、C和D），在这方面，有趣的是，一些双歧杆菌已经被报道为CTLA-4抗体诱导的小肠结肠炎提供保护，而不影响肿瘤生长。由于CTLA-4抗体治疗对缺乏B细胞和抗体的B. pseudolongum单菌定植小鼠也有效，因此ICB治疗后诱导系统性细菌抗体对ICB的促进作用并不是必须的（图S9）。因此，由于细菌不在异位肿瘤中积聚（图S6），CTLA-4抗体治疗降低了肠道屏障的完整性（图S8），并且B. pseudolongum的ICB治疗促进作用不需要B细胞和共生抗体（图S9），我们假设代谢物的全身系统性易位增加可能是导致B. pseudolongum在ICB治疗期间的能在全身起作用的原因。为解决这一问题，从经过CTLA-4抗体治疗的携带肿瘤的GF小鼠、B. pseudolongum或Colidextribacter单菌定植小鼠中收集血清，然后与CTLA-4抗体一起转移到GF-MC38荷瘤小鼠中（图2F）。值得注意的是，来自CTLA-4抗体治疗的B. pseudolongum单菌定植小鼠的血清，而不是来自CTLA-4抗体治疗的GF或Colidextribacter单菌定植小鼠的血清，足以减少肿瘤生长，并在GF小鼠的肿瘤和脾脏中激发强的抗肿瘤免疫（图2，G至I和图S10）。总而言之，这些数据表明源自B. pseudolongum或由B. pseudolongum诱导的可溶性因子对ICB治疗疗效起到了促进作用。

  血清样本的非靶向代谢组学显示，与GF小鼠或Colidextribacter对照菌定植小鼠相比，B. pseudolongum单菌定植小鼠血清中的几种代谢物水平增加（图2J和图S11A和B）。值得注意的是，嘌呤代谢物肌苷是唯一的代谢物，与GF小鼠或Colidextribacter对照菌定植小鼠相比，B. pseudolongum单菌定植小鼠血清中肌苷inosine含量明显更高（8至9倍）（图2K）。值得注意的是，黄嘌呤和次黄嘌呤（肌苷的降解产物）在B. pseudolongum单菌定植小鼠血清中也升高（表S1）。对细菌培养上清液的分析表明，B. pseudolongum h和A. muciniphila产生的肌苷明显高于Colidextribacter。在相同的培养条件下（图S11C），揭示肌苷是由B. pseudolongum h和A. muciniphila产生的细菌代谢物。相反，虽然L. johnsonii不产生肌苷，但与Colidextribacter相比，它确实产生了大量的次黄嘌呤（图S11D），次黄嘌呤是一种与肌苷结合到同一受体上的配体。

  为了测定肌苷在体内的生理水平，我们测定了B. pseudolongum单菌定植小鼠十二指肠、空肠和盲肠中的肌苷含量。肌苷在十二指肠最高，沿胃肠道逐渐降低（十二指肠66.13±14.23μM>空肠29.26±9.38μM>盲肠0.5±0.05μM；图S11F）。我们还定量了CTLA-4和PD-L1抗体治疗的B. pseudolongum单菌定植小鼠清中肌苷的浓度（anti-CTLA-4:26.16±3.32μM，anti-PD-L1:37.5±10.2μM）和Colidextribacter单菌定植小鼠血清中肌苷的浓度（anti-CTLA-4:3.26±1.01μM，anti-PD-L1:4.8±1.3μM）（图S11F），以及CTLA-4抗体治疗前(4.08 ± 1.12 μM)和治疗后SPF小鼠血清中肌苷的浓度（11.65±2.09μM），抗生素处理的SPF小鼠血清中肌苷的浓度（2.03±0.86μM；图S11G）。这些数据表明，细菌在上消化道产生肌苷很可能是B. pseudolongum单菌定植小鼠全身肌苷水平升高的主要来源。

  为了测定肌苷在体内的生理水平，我们测定了B. pseudolongum单菌定植小鼠十二指肠、空肠和盲肠中的肌苷含量。肌苷在十二指肠最高，沿胃肠道逐渐降低（十二指肠66.13±14.23μM>空肠29.26±9.38μM>盲肠0.5±0.05μM；图S11F）。我们还定量了CTLA-4和PD-L1抗体治疗的B. pseudolongum单菌定植小鼠清中肌苷的浓度（anti-CTLA-4:26.16±3.32μM，anti-PD-L1:37.5±10.2μM）和Colidextribacter单菌定植小鼠血清中肌苷的浓度（anti-CTLA-4:3.26±1.01μM，anti-PD-L1:4.8±1.3μM）（图S11F），以及CTLA-4抗体治疗前(4.08 ± 1.12 μM)和治疗后SPF小鼠血清中肌苷的浓度（11.65±2.09μM），抗生素处理的SPF小鼠血清中肌苷的浓度（2.03±0.86μM；图S11G）。这些数据表明，细菌在上消化道产生肌苷很可能是B. pseudolongum单菌定植小鼠全身肌苷水平升高的主要来源。

  肌苷的鉴定最初令人惊讶，因为肌苷与腺苷2A受体（A_2AR）结合，已证明肌苷对体外Th1分化和体内抗肿瘤免疫有抑制作用，事实上，支持腺苷和A_2AR结合后的免疫抑制作用的数据已经导致了新的免疫检查点抑制剂靶点的开发，例如靶向CD73、CD39和CD38的单克隆抗体，以及A_2AR的药理拮抗剂，其中许多药物目前正在临床试验中。然而，一小部分文献已经证明肌苷类似物可以促炎，而A_2AR信号可以维持小鼠的Th1/抗肿瘤免疫。基于这些相反的发现，我们研究肌苷是否可以促进Th1细胞的体外分化。将活化的OVA _323-339肽脉冲骨髓源性树突状细胞（BMDCs）与原始OVA _323-339特异性OT-II CD4⁺T细胞共培养。有趣的是，肌苷在诱导或抑制CD4⁺Th1细胞分化方面的作用被证明是有条件的：具体地说，在外源性IFN-γ存在下，肌苷强烈地促进了T细胞的Th1分化（图3A），而在没有IFN-γ的情况下，肌苷抑制Th1分化（图3B和图S12A）。

  接下来我们解析了肌苷促进Th1分化的分子机制。尽管A_2AR信号的药理抑制完全消除了肌苷的作用，但是细胞渗透性环腺苷酸（db-cAMP，一种A_2AR下游的信号分子），它的加入恢复了Th1的分化，并避开了对肌苷的需要（图3A）。此外，抑制db-cAMP下游效应分子蛋白激酶A（PKA）可抑制肌苷驱动的Th1分化（图3A）。此外，肌苷-A_2AR-cAMP-PKA信号级联导致转录因子cAMP反应元件结合蛋白CREB的磷酸化（图S12B），这是已知的Th1关键分化因子的转录促进剂，如IL-12受体和IFN-γ，事实上，我们还观察到肌苷依赖的IL12Rβ2上调（图S12C）。

  肌苷的作用是T细胞固有的，因为即使在没有IFN-γ的情况下，向已被anti-CD3/anti-CD28-coated beads激活的单纯T细胞中添加肌苷也能增强Th1分化（图S12D） ）（图S12D）。此外，当肌苷刺激A_2AR缺陷型T细胞时，没有诱导Th1分化和CREB磷酸化（图S12，E和F），相反，通过使用db-cAMP避开了对A_2AR信号的需要，促进了A_2AR缺陷型T细胞中Th1分化和CREB磷酸化，证实肌苷对Th1的促进作用依赖于A_2AR信号（图S12、E和F）。此外，由于已知pCREB可以与Th1关键靶基因结合，我们还证实肌苷刺激导致CD4⁺T细胞中Il12rb2和Ifng基因表达持续上调（图S12、G和H）。重要的是，肌苷剂量反应实验显示，在B. pseudolongum单菌定植小鼠而不是Colidextribacter单菌定植小鼠血清中观察到的肌苷生理浓度足以诱导Th1活化（图S12I）。为了证实肌苷介导的Th1体外促进作用是否也适用于体内条件，用卵清蛋白联合CpG作为共刺激物免疫GF小鼠。值得注意的是，我们利用CpG作为一种共刺激物，因为它是一种广泛使用的抗肿瘤佐剂。一天后，小鼠腹腔注射肌苷或载体，肌苷增加了MLN中T-bet⁺IFN-γ⁺CD8⁺和T-bet⁺IFN-γ⁺CD4⁺T细胞的比例（图S12，L到N），验证了我们的体外实验结果。

  接下来，我们确定B. pseudolongum对ICB治疗疗效的增强能力是否需要在T细胞上特异地表达A_2AR，在携带MC38肿瘤的B.pseudolongum单菌定植的Rag1缺陷小鼠中评估抗肿瘤免疫，该小鼠已通过A_2AR缺失或野生型T细胞转移并用CTLA-4抗体治疗（图3C）。我们发现T细胞上A_2AR表达的缺乏降低了B.pseudolongum对ICB治疗疗效的促进作用（图3，D和E）。

  然后，我们确定了肌苷是否可以在不存在B.pseudolongum的情况下促进CTLA-4诱导的抗肿瘤免疫力，用MC38肿瘤细胞激发GF小鼠，在可触及的肿瘤上，口服或全身给予肌苷或PBS，并联合CTLA-4治疗和CpG作为共同刺激物（图3F）。与PBS相比，口服和全身给药肌苷与CTLA-4和CpG一起给药可降低肿瘤重量并提高抗肿瘤免疫能力（图3、G和H）。相反，在没有CpG的情况下，肌苷增加了肿瘤重量，降低了抗肿瘤免疫能力（图3，G和H），验证了我们先前的体外研究结果，即肌苷的作用是有条件的，并且取决于是否存在其它物质的共刺激。肌苷诱导的抗肿瘤免疫也依赖于T细胞中的A_2AR信号，因为口服肌苷不能诱导转移了A_2AR缺失T细胞的MC38肿瘤无菌Rag1缺陷老鼠的抗肿瘤免疫（图3，I到K）。这些数据表明，B.pseudolongum对ICB治疗疗效的促进作用是由肌苷介导的，并且依赖于T细胞中特异的A_2AR信号。

  由于我们在ICB治疗的肿瘤中检测到A.muciniphila（图1G），并且先前证明其可以提高ICB治疗效果并在体外产生肌苷（图S11C），因此我们进一步研究了A.muciniphila是否也依赖于A_2AR信号来增强ICB治疗效果。我们发现，A. muciniphila单菌定植结合CTLA-4抗体治疗可导致更小的肿瘤并提高抗肿瘤免疫能力，这取决于A_2AR的T细胞表达（图S13，A到D）。

  尽管L. johnsonii的单菌定植能够促进合CTLA-4抗体治疗（图1、I至K和图S5）的抗肿瘤作用，但次黄嘌呤（A_2AR的另一配体）在体外培养中升高，而不是肌苷（图S11，C和D）。尽管如此，L. johnsonii的ICB促进作用虽然不如B. pseudolongum和A. muciniphila强，但也部分依赖于A_2AR的T细胞表达（图S13，E至H）。

  接下来，我们测试肌苷在细菌复合物存在的情况下是否也能促进CTLA-4抗体治疗的疗效。我们首先利用了gnotobiotic模型，在该模型中，小鼠被一个由12种细菌组成的微生物群（Oligo-MM 12）稳定地定殖，该微生物群缺少B. pseudolongum。结果在Gnotobitic Oligo-MM 12小鼠中发现肌苷能够促进CTLA-4的抗肿瘤作用，肿瘤大小减小，肿瘤内IFN-γ⁺CD8⁺和IFN-γ⁺CD4⁺T细胞增加（图S14，A到D）。我们还发现肌苷可促进SPF小鼠CTLA-4治疗的效力，SPF小鼠含有高度多样的微生物群（图S14，E至H）。然后我们检查B. pseudolongum增强抗CTLA-4的效力是否需要其有活性。尽管灌胃活的B. pseudolongum，无论是否经过抗生素预处理，都增强了SPF小鼠的CTLA-4的效力（图S14，E至H），但热灭活的B. pseudolongum无法增强ICB治疗的效果，可能是由于无法产生肌苷（图S14，E至H）。

  肌苷除了直接刺激T细胞外，还可能通过改变肿瘤细胞存活率或T细胞介导杀伤的易感性潜在影响肿瘤细胞。然而，MC38肿瘤细胞在体外直接暴露于肌苷并不能调节肿瘤细胞的存活率（图S15A），并且在与活化的肿瘤特异性T细胞共培养之前对MC38肿瘤细胞进行预处理并没有促进或抑制T细胞介导的肿瘤细胞杀伤（图S15B），进一步支持肌苷抗肿瘤作用主要通过T细胞介导的结论。

  综合起来，这些数据表明肌苷对T细胞的作用需要足够的共刺激，IL-12受体参与Th1分化和IFN-γ产生以获得有效的抗肿瘤免疫。事实上，与巨噬细胞相比，传统的树突状细胞（cDCs）被发现是IL-12的主要来源（图S16，A和B）。为了进一步评估树突状细胞（cDCs）在ICB-细菌联合治疗中的作用，将来自cDC-DTR小鼠的骨髓（BM）细胞转移到致死性γ射线照射的受体SPF小鼠中，以允许cDC的诱导性条件耗竭。在骨髓（BM）重建后，用抗生素治疗小鼠，并灌胃三种先前确定的促进ICB的细菌的混合物，即B. pseudolongum, L. johnsonii和Olsenella，10周后，将MC38细胞植入小鼠体内，当发现肿瘤时，通过注射白喉毒素和CTLA-4抗体治疗消除树突状细胞（cDCs）（图S16C）。cDCs的耗竭导致更大的肿瘤（图S16D），肿瘤内CD8⁺和CD4⁺T细胞频率和IFN-γ产生显著降低（图S16E），显著降低IFN-γ的产生和脾CD8⁺和CD4⁺T细胞的增殖（图S16F）。因此，cDCs的耗尽大大降低了细菌诱导的ICB反应而已建立的抗肿瘤效果，提示cDCs需要持续的抗原递呈、IL-12的产生和T细胞的共刺激才能有效地进行ICB治疗，而cDCs和IL-12在PD-1抗体治疗中的关键作用已被报道。

  由于增强Th1免疫通常被认为对大多数抗肿瘤反应是有益的，我们接下来确定在其它肿瘤模型中，用分离的促进ICB疗效的细菌进行肠道定植或用肌苷治疗是否同样有效。首先，我们在SPF Msh2 ^{LoxP / LoxP} Villin-Cre动物中测试了B. pseudolongum, L. johnsonii和Olsenella的ICB疗效促进作用，这些动物在肠上皮细胞中有条件地使Msh2（DNA错配修复基因）失活，并在小肠中发展出腺癌，结果发现在Msh2 ^{LoxP / LoxP} Villin-Cre模型中，单独CTLA-4抗体治疗（不添加ICB促进细菌）导致肿瘤重量、肿瘤中EpCam⁺Lgr5⁺细胞和上皮细胞干细胞标记物下降，肿瘤中T细胞活化和免疫细胞浸润增加（图S17，A至F）。与对照菌相比，同时添加ICB促进细菌显著增强了CTLA-4抗体治疗的作用（图S17G），导致肿瘤重量和EpCam⁺Lgr5⁺细胞进一步减少，肿瘤中的T细胞活化和免疫细胞浸润显著增强（图S17，H至L）。这些结果提示细菌联合治疗可以优化错配修复缺陷（MMRD）肿瘤的治疗方案。由于奥沙利铂/PD-L1抗体联合治疗是临床上更常用的治疗方法，我们还证实了ICB促进细菌增强了SPF Msh2 ^{LoxP / LoxP} Villin-Cre动物奥沙利铂/PD-L1抗体联合治疗的疗效（图S18）。由于B. pseudolongum在ICB治疗动物的AOM/DSS肿瘤中富集（图1，F和G），而且B. pseudolongum先前与改善ICB治疗癌症患者的疗效有关，我们想知道是否在ICB治疗的SPF Msh2 ^{LoxP / LoxP} Villin-Cre动物肿瘤中也富集了B. pseudolongum。结果发现虽然在CTLA-4或PD-L1抗体治疗（图S19A）后，肿瘤相关细菌总数没有变化，但ICB治疗导致肿瘤相关Bifidobacteria双歧杆菌的特异性富集（图S19B）。

  接下来，我们在SPF Apc^2lox14/+；Kras^LSL-G12D/+；Fabpl-Cre小鼠中检测B. pseudolongum, L. johnsonii和Olsenella的ICB疗效促进作用，这些小鼠结肠细胞中具有条件性Apc缺乏和特异性激活Kras。在这个大肠癌模型中，与同型治疗的动物相比，CTLA-4治疗并没有提高存活率（图S20，A和B），并且ICB促进细菌的转移也未能提高存活率（图S20，C和D），这显示了细菌联合治疗在该模型中的局限性。

  最后，我们测试细菌代谢物肌苷联合共刺激是否足以提高ICB治疗其它癌症模型的疗效。在SPF Msh2 ^{LoxP / LoxP} Villin-Cre小鼠中口服肌苷与CTLA-4和CpG治疗可显著降低肿瘤重量，并相应增加脾脏IFN-γ⁺CD4⁺和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞（图4，A至F）。

  重要的是，还发现肌苷与CpG一起可有效提高抗CTLA-4在另外两种癌（膀胱癌和黑素瘤）中的功效。具体来说，向注射了MB49鼠膀胱癌细胞的GF小鼠同时施加肌苷和CpG能够显着增强CTLA-4减轻肿瘤重量的能力，并增加了浸润肿瘤的IFN-γ⁺CD4⁺和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的比例（图4，G至K）。同样，肌苷加CpG增强了黑色素瘤异位小鼠模型中CTLA-4介导抗肿瘤免疫的能力（图4，L至P）。

  综上所述，我们的结果确定了从ICB治疗的结直肠癌肿瘤中分离出的B. pseudolongum(假长双歧杆菌)是一种关键的共生肠道细菌物种，它能够促进cDC(树突状细胞）依赖的Th1细胞回路，从而大大增强ICB疗法在小鼠肠道和上皮性肿瘤模型中的效果（图S21）。这些数据支持这样一个前提，即用特定的微生物联合体对微生物群进行调整，可能为结直肠癌和其他癌症的ICB治疗提供一种有前途的辅助疗法。虽然从老鼠身上分离出来，但这三种促进ICB疗效的细菌也在人类身上发现，这表明它们有转化的潜力。此外，我们分析了已发表的人类粪便微生物组宏基因组数据，发现了一个趋势，尽管并不显著，但与无反应的癌症患者相比，ICB治疗应答者中B. pseudolongum的富集量高达2.4倍（图S22A）。在属水平上，与无应答者相比，ICB治疗应答者中Bifidobacteria双歧杆菌富集量高达5.9倍（尽管不显著）（图S22B），其中，B. longum和B. adolescentis明显富集。由于在成人粪便样本中B. pseudolongum的丰度较低，因此采用更大样本量来证实这一趋势。我们还确定肌苷是一种关键的细菌源性代谢物，通过T细胞特异性A_2AR信号以一种上下文依赖的方式（例如同时需要CTLA-4抗体和CpG的共刺激）促进Th1细胞的激活。我们进一步证实，已知对ICB治疗有响应的A. muciniphila是利用肌苷-A_2AR受体信号来传导其对ICB治疗的促进作用。根据我们的研究结果，可能会警告癌症免疫治疗不要阻断肌苷-A_2AR受体信号传导，因为这可能会抵消有益微生物提供的任何积极作用。我们建议A_2AR受体信号传导可能是细菌-ICB联合疗法不可或缺的抗肿瘤途径，有必要进一步研究黄嘌呤和次黄嘌呤（肌苷的降解产物）的作用。

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