天昊生物功能微生物项目新文：尸体腐烂会增加氮污染并改变饮用水和黄河水中nirK反硝化菌群落的演替

发稿时间：2020-09-11来源：天昊生物

英文题目： Corpse decomposition increases nitrogen pollution and alters the succession of nirK-type denitrifying communities in different water types

中文题目：尸体腐烂会增加氮污染并改变饮用水和黄河水中nirK反硝化菌群落的演替

期刊名：Science of the Total Environment

影响因子：6.551

尸体分解作为一种高质量的营养物质输入，会对水体环境产生强烈的扰动，如导致高氮或高硝酸盐污染。反硝化细菌可以将硝酸盐还原为氮气，从而减少氮污染，提高水生生态系统的自我净化能力。然而，水体中的nirK反硝化菌群落对尸体分解的反应仍然是未知的。因此，我们采用高通量测序和化学分析方法，研究了自来水和黄河水中nirK型反硝化菌群落及其相应的对照组在两个重要的鱼尸体分解阶段（即晚期漂浮腐烂和沉没残骸）中的演替。我们的数据显示，实验组的NH₄⁺-N浓度比对照组增加了大约3-4倍，Proteobacteria是nirK反硝化菌群落的优势类群。尸体群中富含Brucella和Achromobacter等几种潜在致病菌属。值得注意的是，尸体分解会显著改变nirK反硝化菌群落结构。随着演替的进行，尸体群的群落结构变得更加相似，表明群落组成在最后阶段趋同。水体pH、氧化还原电位（ORP）和处理是影响群落结构的三个重要因素。但是，水体类型并不是决定尸体相关nirK反硝化菌群落的主要驱动因素。在反硝化菌群落中检测到4个系统发育簇，但在尸体和对照组之间的分布有显著差异。这些结果为深入了解动物尸体分解过程中nirK反硝化功能菌群和潜在致病菌提供了深入的认识，为环境评价和管理提供了有价值的参考。

实验程序和采样：

实验于2018年7月进行。首先，我们从兰州黄河段和当地的实验室水龙头采集足够的水到干净的塑料桶中。从当地鱼类批发市场购买红锦鲤20条（体重78.52±0.95g），作为分解动物模型。所有鱼均采用过量麻醉处死，然后将其随机置于预先装满800ml水的塑料盒（20cm×18cm×15cm）中。将10个鱼尸体分别放置在10个装有自来水的盒子中，十个没有任何尸体的装有自来水盒子作为对照。同样，剩余的鱼尸体（n=10）被放置在盛产黄河水的盒子中，十个没有任何尸体的装有黄河水盒子作为对照。上述四组分别命名为TF（有尸体的自来水）、T（无尸体的自来水）、YF（有尸体的黄河水）和Y（没有尸体的黄河水）。对鱼尸体的观察是在降解过程中开始的，我们收集了最后两个阶段的水样：晚期漂浮腐烂（第15天）和沉没残骸（第19天）阶段。每组有5个重复。从盒子中采集250 ml自来水，然后使用0.22μm纤维素膜过滤；用0.45μm滤膜过滤250ml黄河水，然后用0.22μm滤膜再次过滤。在提取DNA之前，将每个样品的相应滤膜及时保存在−20°C下。此外，还收集了额外的水样（约100-150 ml），用于测量以下理化性质。

理化性质分析：

对每个水样品的理化参数进行分析，包括pH值、氧化还原电位（ORP）、电导率（CON）、氨态氮（NH₄⁺-N）、总溶解固体（TDS）、盐度（Salinity）和总有机碳（TOC）。

二代测序：

使用滤膜提取基因组DNA，然后进行nirK功能基因扩增子测序（583F/909R）。

尸体降解过程中环境因子的变化

几乎所有的环境因素都受到尸体的影响。例如，尸体组的平均pH值在7.16至8.40之间，并且无论水体类型或时间点，始终显著低于对照组（均p<0.05）。对照组的氨态氮（NH₄⁺-N）值在5.12～15.12之间，而在尸体组氨态氮（NH₄⁺-N）从16.83变为41.06，因此在鱼腐烂过程中氨态氮增加了大约3～4倍。相对于对照，尸体组的盐度和总溶解固体（TDS）分别增加了约100倍和10倍。相对于对照，尸体组的ORP也显著增加。而总有机碳（TOC）在实验组和对照组之间几乎没有变化，除了Y和YF组。另外，两个尸体组在各时间点的水质理化因子，如NH₄⁺-N、pH、ORP、CON、TDS、盐度等均无显著性差异，说明两组尸体虽然水体类型不同，但环境条件相似。在尸体降解过程中，实验组NH₄⁺-N、pH和TOC在第15-19天呈上升趋势，而ORP、CON、TDS和盐度则呈相反趋势。

测序结果

本研究共收集40份样本进行DNA提取和PCR扩增，但有3份未能成功扩增，从37个水样中共获得3226302条序列，质量调整后，共获得1769047条序列（每个样本平均47812条序列）。用Framebot 进行移码矫正后，去除嵌合体、singletons和数据标准化后，每个样本精简到3282条序列，并根据97%的核苷酸相似度将所有序列聚类为543个OTUs。OTU水平上，样本的Goods coverage（平均值±SE）为99.10%±0.05%，说明测序数据覆盖了大部分水体反硝化菌群落多样性。此外，稀释性曲线趋于平坦，表明测序结果反映了绝大多数的群落信息。

对照组与鱼尸组nirK反硝化菌群落α多样性的差异

对于α多样性，ANOVA分析显示尸体分解对nirK反硝化菌群落的α多样性值无显著影响，只有水体类型对Shannon，Simpson，Chao I和observed OTUs有显著影响。此外，Mann-Whitney U检验检验显示Shannon，Simpson，Chao I和observed OTUs等指数在对照组和尸体组也没有表现出显著差异（图1）。此外，环境因素与α多样性之间没有显著相关性。

尸体分解过程中不同组间nirK反硝化菌群落β多样性比较

使用NMDS分析在尸体分解的两个阶段（晚期漂浮腐烂和沉没残骸）黄河水和自来水中nirK反硝化菌群落成员关系（基于Jaccard 距离）和结构（基于Bray-Curtis具体）上的差异（图2）。首先，除5T和5TF外，nirK反硝化菌群落的群落成员组成和结构与对照组相比有显著差异；PERMANOVA和ANOSIM分析（表1）进一步证明了这些差异，表明尸体分解显著改变了水中反硝化菌群落的群落成员和结构。第二，4TF（第15天有鱼尸体的自来水）和4YF（第15天有鱼尸体的黄河水）之间存在微弱差异，而5TF（第19天有鱼尸体的自来水）和5YF（第19天有鱼尸体的黄河水）之间没有显著差异，这表明尽管不同的水类型，尸体降解过程使nirK反硝化菌群落的成员组成和结构更加相似，PERMANOVA和ANOSIM分析也证实了这一结果。最后，4TF与5TF以及4YF和5YF无显著性差异，说明同一类型水体的反硝化菌群落在不同阶段间无显著差异。

尸体分解过程中水体中nirK反硝化菌群落的组成

在门水平上，水体中nirK反硝化菌群落主要由Proteobacteria组成（平均相对丰度为81.73%），其次为未分类细菌（18.27%）（图3）。为评估尸体分解过程中Proteobacteria丰度的变化，采用单向方差分析比较不同组间Proteobacteria平均相对丰度的变化，值得注意的是，黄河水体组Proteobacteria的平均相对丰度在漂浮腐烂晚期和沉没残骸期在尸体组显著高于对照组，而自来水中Proteobacteria的平均相对丰度仅在漂浮腐朽晚期（第15天）在尸体组略有增加。

在属水平上，nirK反硝化菌群落以Sinorhizobium (47.43%)、Pseudomonas (9.52%)、Achromobacter (3.75%)、Ensifer (3.09%)、Agrobacterium (2.16%) 、 Brucella (2.02%)为主。其他稀有属（平均相对丰度<1%）包括Rhizobium、Mesorhizobium、Bradyrhizobium、Rhodopseudomonas、Starkeya、Alcaligenes、Ochrobactrum、Chelativorans、Pusillimonas、Roseobacter（图4）。为了确定在尸体腐烂过程中发生显著变化的属，还使用了单向方差分析来比较不同组之间属的平均相对丰度的变化。自来水中，从对照组到尸体组，Sinorhizobium的平均相对丰度显著增加，而Rhodopseudomonas在第15天显著减少，而在第19天TF组Bradyrhizobium明显减少。在黄河水中，Mesorhizobium的平均相对丰度在第15天从对照组到尸体组均无明显下降，第19天，YF组的Brucella数量显著增加。

LEfSe分析也用于区分自来水和黄河水中尸体组和对照组之间的丰富类群（图5），在自来水和黄河样品中分别检测到17个和11个生物标志物，LDA值均超过3.6。在自来水中，TF组中差异丰度最高的细菌有lcaligenaceae、Burkholderiales、Betaproteobacteria、 Achromobacter、Brucellaceae、Brucella、 Ochrobactrum，而对照组T中差异最丰富的成员是Ensifer、Rhizobiaceae、Rhizobiales、Alphaproteobacteria（图5a）。在黄河水中，LEfSe分析鉴定出Brucella、Brucellaceae、Agrobacterium、Alcaligenes在尸体组YF中富集，而对照组Y的生物标志物则是Alphaproteobacteria 和Rhizobiales（图5b）。

鱼腐烂条件下环境参数对nirK反硝化菌群落的影响

环境因子与前10个属的相关性如图6所示。在属水平上，Spearman相关分析表明，pH值与Sinorhizobium（r=-0.571，p<0.01）、Achromobacter (r = −0.715, p < 0.05)、 Brucella (r = −0.647, p < 0.01)、Rhizobium (r = −0.421, p < 0.01) 、 Mesorhizobium (r=−0.473, p < 0.01)呈显著负相关，pH值与Bradyrhizobium（r=0.570，p<0.01）和Rhodopseudomonas（r=0.493，p<0.01）呈正相关。RDA进一步表明，pH值与不同属间有很强的相关性。NH₄⁺-N和ORP与菌属间的相关性与pH值相反，NH₄⁺-N与Sinorhizobium(r=0.330,p<0.05)、Pseudomonas(r=0.367,p<0.05)、Achromobacter (r = 0.720, p < 0.01)、 Brucella (r = 0.517, p < 0.01)呈正相关；与Bradyrhizobium (r = −0.605, p < 0.01) and Rhodopseudomonas (r = −0.488, p < 0.01) 呈负相关。

为了探讨环境因素对nirK反硝化群落成员组成和结构的影响，mantel检验表明，在Jaccard和Bray-Curtis距离上，pH是影响nirK反硝化群落的最显著因素，其次是ORP、处理、NH₄⁺-N、TDS、盐度、水类型和CON（表2）。

与尸体降解相关的核心反硝化细菌

与尸体降解相关的核心反硝化微生物根据所有尸体样本中至少80%的样本中出现的OTUs来确定。核心微生物（31个OTU）占nirK反硝化群落的78.23%相对丰度（图7a）。核心OTUs成员中大部分（45.26%）属于Pseudomonas，第二优势成员隶属于Rhizobiaceae（UG），占所有核心OTU的14%（图7b）。OTU4_s_Achromobacter xylosoxidans与pH、NH ₄⁺ -N呈正相关，与ORP呈负相关（图7c）。

nirK反硝化群落的系统发育聚类分析

nirK反硝化核苷酸的系统发育邻域连接分析表明，65个优势OTU（平均相对丰度>0.1%）分为四个聚类（图8）：聚类1以Sinorhizobium（14个OTU）为主，聚类2以Pseudomonas（9个OTU）为主，聚类3个以Ensifer（1个OTU）为主，聚类4以未分类细菌（18个OTU）为主。在聚类1中，尸体组的OTUs相对丰度显著高于对照组，而聚类4在对照组中显著高于尸体组。

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