01

原理：

◆首先利用细菌（16S）或真菌（ITS）的通用引物进行qPCR，获得样本总细菌或总真菌的总拷贝数；

◆然后使用常规细菌16S相对定量扩增子测序或者常规真菌ITS相对定量扩增子测序获得每个物种相对丰度（百分比）；

◆通过微生物总拷贝数和物种相对丰度的乘积来推断每个微生物的绝对丰度。

优点：

应用比较灵活，对已有常规扩增子测序结果的项目可以补加微生物总拷贝数qPCR检测，从而转化成绝对定量结果。

局限性：

◆微生物总拷贝数与各菌种相对丰度信息分别来源于qPCR和高通量测序两个独立检测方法，两种方法检测都存在一定误差，并且这种误差无法得到矫正，从而使获得的特定菌种拷贝数准确性受到影响。

◆这种联合只适合高丰度物种（物种的相对丰度大于10%）的绝对丰度推断，当物种的相对丰度较低时，这种联合分析推断的绝对丰度估计值很容易出错，并且可能在从低细菌丰度增殖时期和后期收缩到低丰度的过程中可能会歪曲单个物种的动力学。

◆qPCR进行微生物总拷贝数定量时，构建标准曲线的标准品不含有腐殖酸而环境样本则含有腐殖酸，并且两者在两个样本孔中分别进行各自的PCR反应，所以PCR反应效率不同，因此微生物总拷贝数qPCR定量结果会有偏差，从而对后续获得的特定菌种拷贝数准确性有影响。

相关文献解读：

相对丰度会歪曲实际丰度，联合16S扩增子测序和总菌qPCR获得的绝对丰度可靠吗？；

Atmospheric Environment：对真菌气溶胶种群进行相对丰度和绝对丰度比较研究；

02

原理：

◆首先利用流式细胞技术获得样本的总细胞数（单位为细胞数/μl水体、细胞数/ g粪便）；

◆然后使用常规相对定量扩增子测序获得每个物种相对丰度（百分比）；

◆通过总细胞数和物种相对丰度的乘积来推断每个微生物的绝对丰度（单位为细胞数/μl水体、细胞数/ g粪便）。

粪便样本流式细胞计数具体步骤：在生理溶液中将0.2 g样品稀释100000倍，为了去除粪便溶液中的碎屑，使用无菌注射器过滤器（孔径5μm）对样本进行过滤；接下来用1μl SYBR Green I（在二甲基亚砜中稀释1:100；在37°C下孵育15分钟）对获得的1 ml微生物细胞悬浮液进行染色；用FL1 533/30 nm和FL3>670nm光学检测器检测荧光，前向和侧向散射光也被收集，从而对悬浮液中存在的微生物细胞数目进行分析。

水体样本流式细胞计数具体步骤：水体样本在无菌0.22µm过滤瓶装矿泉水中稀释两次，并在室温下放置10分钟；用SYBR Green I（10000倍浓缩液）染色，并在37°C下培养20分钟（SYBR Green I最终浓度=1倍浓缩液）；在四个荧光检测器（530/30 nm，585/40 nm，>670 nm，675/25 nm）和两个散射检测器（50µL/样品固定体积模式）上通过流式细胞仪器进行分析，以便准确量化细胞数目。

优点：

直接计数微生物的细胞数，不需要将16S基因拷贝数矫正成微生物细胞数

局限性：

◆流式细胞仪器较昂贵，流式细胞计数涉及样本前处理、荧光染色和细胞计数过程，过程复杂，操作要求高；

◆需要根据不同类型样本，优化最佳的上样浓度、染色剂浓度、孵育时间、上样速度、读取时间、仪器检测参数，因此需要针对不同类型样本优化最佳检测体系；

◆适合液态样本检测，像土壤粪便等样本需要溶解稀释并过滤去除杂质才能上样检测。

相关文献解读：

Nature：要想真正研究宿主-肠道微生物的相互作用，必须将相对定量变成绝对定量；

The ISME Journal：为什么微生物相对定量不能代替绝对定量；

03

原理：

◆向样本中直接加入一种已知拷贝数的外源自然界已知菌株或其DNA，混匀后，然后进行常规扩增子测序；

◆根据内标菌株已知的绝对数量，及通过扩增子测序分析获得内标菌株的相对丰度，可以计算出样本原生微生物的总绝对丰度以及每个微生物的绝对丰度。

优点：

◆不但可以进行Alpha多样性分析、群落组成分析、Beta多样性分析和环境因子分析等常规扩增子测序分析；

◆还可以同时解析样本中特定物种和总细菌的绝对拷贝数；

◆如果从样本开始就加入内标菌株，就可以校正从抽提到测序整个流程的实验误差。

局限性：

◆内标菌株是自然界已知存在的菌，内标菌株加入可能会影响样本中原生此菌的定量；

◆只有单个标准点，没有引入标准曲线，存在可靠性无法验证的问题

相关文献：

Smet et al. A method for simultaneous measurement of soil bacterial abundances and community composition via 16S rRNA gene sequencing . Soil Biology & Biochemistry, 2016, 96, 145-151.

04

原理：

该方法通过向样品DNA中添加梯度拷贝数的内标序列（内标序列为人工合成的16S rRNA基因部分序列，与自然界所有菌的对应序列相比具有特异性），然后将混合样本一起进行PCR扩增、文库构建、测序，再根据内标序列的16S扩增子reads数及其绝对拷贝数绘制标准曲线，计算出样品中OTUs代表序列对应物种16S rRNA基因绝对拷贝数，然后天昊生物基于创新算法将OTUs水平的16S基因拷贝数矫正成物种水平的16S基因拷贝数，基于矫正过的16S基因拷贝数数据进行后续的生信分析结果更加真实可靠。

优点：

◆不但可以进行Alpha多样性分析、群落组成分析、Beta多样性分析和环境因子分析等常规扩增子测序分析；

◆还可以同时解析样本中特定物种和总细菌的绝对拷贝数；

◆进行细菌拷贝数定量时，构建标准曲线的内标和样本DNA是在同一个样本孔中一起进行PCR反应，所以PCR反应效率相同，因此校正了腐殖酸对PCR的影响，避免了腐殖酸等PCR抑制物对环境样本（例如土壤，水体和淤泥）细菌16S拷贝数定量的影响，因此特别适合土壤和水体样本的微生物绝对定量。

局限性：

◆测序数据量高于常规微生物16S扩增子测序，成本有所增加；

◆实验所需的样本DNA量高于相对定量扩增子测序

相关文献解读：

喜讯！天昊生物16S扩增子绝对定量测序项目文章再次登陆《Science of the Total Environment》；

又一篇！天昊生物微生物16S扩增子绝对定量测序技术再发好文；

祝贺！天昊生物16S扩增子绝对定量测序技术助力客户登陆Science of the Total Environment；