客户文章|天昊iMLDR®多重SNP分型技术助力湖羊睾丸发育遗传研究

发稿时间：2020-05-08来源：客户文章|天昊iMLDR®多重SNP分型技术助力湖羊睾丸发育遗传研究

兰州大学草地农业科技学院乐祥鹏老师课题组近期在动物遗传育种杂志《Animals》上发表论文，发现DAZL基因中两个SNPs与湖羊睾丸重量变异系数显著相关，可作为早期公羊选择重要指标。本研究采用了天昊生物iMLDR^®多重SNP分型技术，在恭喜客户文章发表的同时，我们也跟大家一起分享下本文的研究思路。

英文题目：Expression of DAZL Gene in Selected Tissues and Association of Its Polymorphisms with Testicular Size in Hu Sheep

中文题目：湖羊DAZL基因在特定组织中的表达及其多态性与睾丸大小的关联

期刊名：Animals

影响因子： 1.832

发表时间：2020-4-23

研究摘要

一种编码RNA结合蛋白的无精症样缺失(Deleted in Azoospermia-Like, DAZL)基因在许多物种的配子体发生中起着关键作用，也是减数分裂前的标志物。本研究采用qPCR、DNA混池测序、天昊生物iMLDR^®多重SNP分型技术和RFLP方法，检测了绵羊DAZL基因的表达和SNPs。结果证实，绵羊在六个月大的时候，DAZL在五个发育阶段表现出最高的表达水平。在6个月的阶段对7个组织的检测发现，DAZL主要在的睾丸中的表达。尽管不够显著，但DAZL在大睾丸组中的表达高于小睾丸组。此外，在DAZL发现了六个SNPs (SNP1-SNP6)。其中，SNP1 (p < 0.05)和SNP6 (p < 0.01)与左右附睾重量变异系数(VCTW)显著相关。目前的研究表明，DAZL可能在睾丸发育中发挥重要作用，其SNPs与睾丸参数相关，为早期公羊选择提供重要指标。

研究背景

人工授精在动物生产中已广泛应用，精液质量高的雄性有助于加速基因改良。养羊业选择高繁殖力的优良公羊是非常重要的。传统上，精液的数量和质量是评价公羊繁殖力的重要指标，但它具有较低的可遗传性。以前的研究发现，睾丸大小与射精量、精子活力和精子密度呈正相关，与精子形态异常呈负相关。此外，睾丸大小易于测量并具有高遗传力，这表明它是选择具有高繁殖力的候选公羊的一个极好的指标。因此，筛选与睾丸发育相关的重要候选基因的遗传变异有助于早期选择优良公羊。
无精子症缺失(DAZ)家族是一类RNA结合蛋白，它在精子发生、配子发生和出生后雄性生殖细胞发育中起重要作用。该家族由三个成员组成，包括一个Y染色体DAZ基因和两个常染色体同源基因：无精症样缺失(DAZL)基因和boule样RNA结合蛋白(BOLL，也称为BOULE) 基因。在人类中，DAZL的SNPs已被发现对中国人口的男性生育力有显著影响。
本研究检测了DAZL在湖羊心、肝、脾、肺、肾、背最长肌和睾丸中的表达模式，并比较了其在新生期、青春期、性成熟期、体成熟期和成年期睾丸中的表达。此外，还应用了DNA混池测序、iMLDR®多重SNP分型技术和RFLP方法来筛选DAZL中与睾丸大小和相关性状相关的SNPs。本研究旨在为湖羊动物育种提供理论和实践意义，并为湖羊早期标记辅助选择提供分子标记。

材料和方法

本研究选取352只出生体重相近、出生年龄相近、无隐睾的健康雄性湖羊羔羊。将该群体分为5组，分别为0天、3个月、6个月、12个月和24个月屠宰的M0(新生期，n = 3)、M3(青春期，n = 3)、M6(性成熟，n = 340)、M12(身体成熟，n = 3)和M24(成年，n = 3)。屠宰后，测量睾丸和附睾的重量和体积，并立即采集睾丸和附睾样品。此外，在所有M6个体中选择3只接近平均睾丸重量的湖羊，采集心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和背最长肌的样本。分别提取DNA和总RNA，进行后续qPCR、RFLP和iMLDR^®多重SNP基因分型，为了验证iMLDR^®的准确性，检测包含2个ddH₂O在内的6个随机重复双盲样品。

研究结果

3.1、DAZL在不同生长阶段睾丸中的表达

通过qPCR检测不同生长阶段(M0、M3、M6 M12和M24)睾丸中的DAZL表达。通过Kruskal–Wallis秩和检验对五个生长阶段的基因丰度进行了比较，结果显示DAZL在M6的表达最高(图1)。

图1、睾丸发育过程中DAZL基因的表达水平。

3.2、DAZL在M6不同组织和不同大小睾丸中的表达

DAZL在这个阶段显示出最高的表达水平，因此对DAZL的基因表达水平在M6的不同组织和不同大小的睾丸中进行了进一步分析。选取湖羊的心、肝、脾、肺、肾、背最长肌和睾丸，以及最大(L)和最小(S)睾丸。表达结果显示，DAZL在睾丸中表达极高，显著高于在肾脏中的表达(图2A)。DAZL在大睾丸组的表达高于小睾丸组，但无统计学显著差异(p = 0.34) (图2B)。

图2、DAZL在6月龄(M6)不同组织和不同大小睾丸组中的表达水平。

3.3、SNP检测和基因分型

在这项研究中，通过DNA混池测序共检测到6个SNPs (表2)。

表2、检测到的单核苷酸多态性的位置和突变类型

SNP1-SNP5可以通过iMLDR^®方法进行基因分型，而SNP6可以通过限制性内切酶AluI (A^GCT)识别并通过PCR-RFLP进行基因分型。在SNP6中观察到三种基因型：GG型、GA型和AA型。在SNP6基因座中，GG基因型在琼脂糖凝胶电泳中显示159 bp的条带。杂合子遗传型显示了159 bp、92 bp和67 bp的三个条带。AA基因型显示了92 bp和67 bp的两条条带(图3)。

图3、DAZL的SNP6基因座三种基因型的琼脂糖凝胶电泳。

所有6个单核苷酸多态性都成功地进行了基因分型，基因型和等位基因频率等见表2。除了SNP2外，其余SNPs显示出中度多态性。

表3、DAZL的SNPs基因型和等位基因频率、预期杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)、多态性信息含量(PIC)、哈迪-温伯格平衡(HWE)检验p值。

3.4、SNPs与睾丸大小参数的关联分析

Shapiro检验的结果表明，所有的表型都偏离了常态。为了使表型尽可能地服从正态分布，用sqrt()转换非比率变量，用asin(sqrt())转换比率变量。采用方差分析和非参数方法进行SNPs关联分析。结果表明两种统计方法具有一致的结果(表4)。SNP1对左右附睾重量的变异系数有显著影响(VCEW, p < 0.05)，SNP6与VCEW有极强的相关性(p < 0.01)。其余的SNPs对睾丸参数没有显著影响(表4)。

表4、DAZL的SNPs与睾丸性状的关联分析。

3.5、连锁不平衡分析

利用HAPLOVIEW软件对DAZL鉴定的6个SNPs之间的连锁不平衡进行分析，结果显示，除了SNP2与SNP1和SNP6未显示强连锁外，其余的SNPs都为强连锁不平衡 (图4)。

图4、6个SNPs的连锁不平衡分析。

此外，还获得5种单倍型。TTCGGG是频率最高的单倍型，为0.537，CTTAAA次之，为0.224，TTTAAG、TGCAAG和CTTAAG分别为0.189、0.027和0.014。

此外还分析了6个SNPs的基因单倍型。总共有4个单倍型(CTTTCTGAGAGAGA、CTTTTTAAAAGA、TTTTTTCCGGGGGG和TTTTCTGAGAGG)用于该群体的进一步分析(表5)。结果表明，不同单体型间的变异系数差异显著(表5)。CTTTCTGAGAGA单倍型的VCEW显著高于TTTTCCGGGGGG和TTTTCTGAGAGG单倍型。

表5、不同单体型与睾丸性状的关联分析。

研究结论

在本研究中，研究者对湖羊DAZL的表达进行了研究，揭示了主要在睾丸中表达，并且在6个月时大睾丸比小睾丸具有更丰富的表达。此外，DAZL的表达水平在睾丸发育的6个月达到高峰。在DAZL共发现6个SNPs，其中SNP1和SNP6对左右附睾重量的变异系数有显著影响。这些发现表明，DAZL在睾丸发育过程中至关重要，其与睾丸参数相关的SNPs可为早期公羊选择提供重要指标。

昊技术：