自2019年2月首篇利用10x Genomics的植物根尖单细胞图谱“Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells”发表在Plant Physiology以来，陆续有相关研究见刊Developmental Cell 和Plant Cell。国内第一篇植物10x单细胞转录组测序（scRNA-seq）文章也于同年4月由植生所王佳伟研究组发表在 Molecular Plant上，题为"A single-cell RNA sequencing profiles the developmental landscape of arabidopsis root"。进入2020年以来，10x Genomics单细胞转录组测序在植物上的应用有了新的发展，已经从根尖细胞发育拓展到对植物幼苗地上部分组织细胞的研究上，相关研究在线预发表在1月和2月bioRxiv上。今天我们就来简单看下这两篇文章。
1、题目：Single-cell transcriptome analyses recapitulate the cellular and developmental responses to abiotic stresses in rice
利用单细胞转录组分析水稻细胞和发育对非生物胁迫的响应
发表期刊：bioRxiv 发表时间：2020-1-31
https://doi.org/10.1101/2020.01.30.926329
研究简介
植物的新陈代谢和繁殖取决于细胞之间的分工。然而，具有各种功能的细胞通常作为一个整体进行研究，其特异性易被稀释掉。本研究将单细胞RNA测序应用于在各种环境中生长的水稻幼苗的地上部分。实验通过捕获成千上万个细胞的转录组，识别所有主要的细胞类型，并重建它们的发育轨迹。研究者发现，非生物胁迫不仅影响细胞类型的特异性基因表达，还影响细胞的物理大小和细胞群体的组成。实验用显微镜验证了其中一些结论，并用生信分析方法揭示相关发生机制。总的来说，本研究展示了水稻幼苗单细胞转录组图谱相关数据，为推动植物生物学发现提供有利资源支撑。
材料与方法
植物材料和生长条件
水稻幼苗在Kimura B溶液中生长14天。对于高盐度处理，幼苗在Kimura B溶液中生长11天，然后转移到高盐度溶液(Kimura B溶液加200mM NaCl)中再生长3天。对于低氮处理，幼苗在Kimura B溶液中生长9天，然后转移到低氮溶液(木村B溶液仅含20 mM NH4+)中再生长5天。两周大的幼苗的地上部分被收获用于scRNA-seq分析。
原生质体的分离
从两周大幼苗中分离水稻原生质体。幼苗的茎和鞘部分被切成0.5-1毫米的条状，用新磨尖的刀片。将条带立即转移到新鲜制备的酶溶液中，包括1.5% (w/v) cellulase R10、0.4% (w/v) macerozyme R10、0.6 M甘露醇、20 mM KCl、20 mM MES (pH = 5.5)和0.1% BSA。植物材料(0.5 g)在室温下于黑暗中于5 ml酶溶液中孵育。在3 h轻微摇动后，消化混合物依次通过70 mm和40 mm尼龙筛网过滤。在洗涤两次后收集原生质体(300 g离心3分钟)，并重新悬浮在8%甘露醇溶液中。用台盼蓝染色原生质体，用细胞计数器测定细胞活力和数量。
scRNA-seq
根据10x Genomics官方方案及试剂盒，用新鲜原生质体构建scRNA-seq文库，并用Illumina HiSeq双端150 nt模式进行测序。对测序数据使用STAR、Cell Ranger进行单个细胞基因表达水平的估计和差异基因的鉴定。使用R包进行UMAP降维及细胞聚类分析。此外还利用前人研究的细胞特异性基因来鉴定细胞类群，对非生物胁迫下细胞特异性应激反应基因进行鉴定及发育轨迹等分析。
实验结果
水稻幼苗地上部分主要细胞类型的鉴定
利用scRNA-seq获得了总共4580个细胞的转录组，测得的UMIs和基因数量中位数分别为10256和2480个。通过UMAP分析及利用相互最近邻法 (MNN)来校正批次效应，最终将细胞分为五大类群 (图1B)。根据已知功能基因的簇特异性表达将细胞分为五种类型—叶肉细胞、薄壁细胞、表皮细胞、泡状细胞和原基细胞(图1C)。
图1、水稻幼苗单细胞转录组图谱。(A)单细胞转录组工作流程示意图。(B)UMAP降维和五大细胞类群分类结果。(C)簇特异性基因的表达模式图。
非生物胁迫诱导的转录组变化因细胞类型而异
从未处理对照和低氮及高盐处理的幼苗样本中鉴定出所有五种细胞类型(图2A)。之后在低氮或高盐处理后，为每种细胞类型分析了差异表达基因（DEGs）及GO富集分析（图2B-2D）。在所有五种细胞类型中，高盐度和低氮处理的样品之间的转录差异存在着显著重叠，这意味着植物可能通过调节网络的共同基因转录对各种非生物胁迫做出响应（图2E）。
图2、细胞类型特异性转录组对非生物胁迫的响应。(A)在UMAP图中三种不同处理的样品在很大程度上相互重叠。(B)在低氮处理下，散点图显示叶肉细胞和薄壁细胞中的基因表达不同(红色)。(C)对低氮胁迫有响应的特异和共有细胞差异基因统计。左边的条形图显示了每种细胞类型的差异基因数(包括上调和下调)。上下条形图分别显示基因上调和下调数量。(D)低氮胁迫下每种细胞类型差异基因GO富集分析图。(E)利用基因子集的UMAP分析。
mRNA的减少揭示了在应激反应期间表皮细胞变得更小
一个细胞中的总UMI值，反映了在scRNA-seq实验中捕获的整体mRNA群体，在某些细胞类型中其因胁迫而显著不同(图3A)。特别是，在低氮和高盐处理下，表皮细胞中的总UMI显著降低。据报告，一个细胞中的总与其在人体中的身体大小呈正相关；或者，总UMI可以简单地反映细胞中RNA聚合酶的活性。为了验证这些可能性，实验从显微图像中估计细胞大小。在两种压力下，表皮细胞的面积都减少了，特别是在高盐度下(图3B-C)，表明每个细胞的总UMI数可以用来推断表皮细胞的大小。为了理解胁迫应激导致表皮细胞尺寸减小的潜在机制，研究者重建了从原基到表皮细胞的发育轨迹(图3D-E)。虽然在所有三种情况下，总UMI数都随着发育而增加，但比率是不同的(图3F)。在低氮条件下生长的植物在原基-表皮细胞转变过程中表现出细胞扩张的延迟。除此之外，在高盐度条件下生长的植物显示出原基和表皮细胞的整体大小减小，这可能与渗透压增加导致细胞壁上的膨压降低有关。总的来说，这些结果揭示了非生物胁迫导致细胞类型特异性大小变化。
图3、细胞大小对非生物胁迫的响应。(A)在高盐度和低氮胁迫下，某些细胞类型中的总UMI值显著降低。(B-C)对照和胁迫处理样品中表皮细胞的细胞大小统计。(D-E)从原基到表皮细胞的发育轨迹。(F)细胞大小(从细胞的总UMI推断)随着拟时轨迹的变化而增加。
非生物胁迫减缓向叶肉细胞的分化
非生物胁迫处理也改变了细胞群体的组成(图4A)。特别是叶肉细胞的比例减少，薄壁细胞的比例增加，以应对高盐或低氮胁迫。在显微镜下，观察到红色自发荧光的强度降低了约50%，这是由主要存在于叶肉细胞中的叶绿体发出的(图4B–C)。为了理解潜在的发育机制，实验重建了从原基到叶肉和薄壁细胞的发育轨迹。研究者观察到从原基到叶肉细胞的主要发育轨迹，薄壁细胞作为中间体(图4D–E)，这与叶肉细胞主要由折叠的薄壁细胞组成相呼应。为了研究非生物胁迫对细胞增殖和分化的影响，从66个组蛋白编码基因的平均表达水平推断了细胞增殖速率，这些基因在DNA合成阶段特异性表达。在所有三种情况下，发育轨迹上的增殖速率显著降低(图4F)。值得注意的是，在高盐度或低氮处理的薄壁组织-叶肉转变过程中，细胞增殖受到显著抑制(图4F)。为了进一步剖析胁迫下减缓叶肉细胞分化的调控机制，研究者在发育轨迹中鉴定了1496个高度可变的基因。这些基因分为四个不同的基因类别，并在整个发育过程中以有序的时间顺序描述基因表达的波动(图4G-H)。在拟时时间轴中间表达的基因与薄壁细胞向叶肉细胞的转变有关。这较好解释了薄壁细胞在脂质储存和代谢中起作用，而脂质储存和代谢通常与应激反应有关，叶肉细胞的延迟发育不仅有利于水稻幼苗减少光合作用的能量消耗，而且促进了对恶劣环境的抗性。
图4、细胞群体对非生物胁迫的组成响应。(A)高盐度或低氮胁迫下细胞类型比例的变化。该比例通过将一种类型的细胞数除以样品中捕获的细胞总数来计算。(B-C)在三种条件下生长的水稻幼苗水平切片的显微图像及统计。(D-E)原基向薄壁细胞和叶肉细胞分化的发育轨迹。每个点代表一个细胞，并由伪时间(D)或细胞类型(E)着色。(F)增殖速率随着发育拟时轨迹变化而降低，特别是在非生物胁迫下。(G-H) 在发育轨迹中的基因动态表达图及统计。
实验结论
在这项研究中，研究者首次尝试将scRNA-seq应用于水稻样品的地上部分，没有进行相同处理的重复，因为数百个单独的细胞可以作为重复。进行了两种胁迫处理(低氮和高盐)，观察到部分共有的转录响应情况。总UMI值的变化本研究中被用来推断细胞大小。原生质体的效率可能因处理不同而不同。用显微数据验证了胁迫处理后叶肉细胞数量的变化。
2、题目：Global dynamic molecular profiles of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing
用单细胞转录组测序研究气孔细胞发育的全局动态分子特征图谱
发表期刊：bioRxiv 发表时间：2020-2-14
https://doi.org/10.1101/2020.02.13.947549
研究简介
气孔谱系细胞发育的调控虽然已有广泛研究，但是基于单细胞转录组分析这一生物过程的综合特征尚未有报道。在这里，研究者对来自5日龄拟南芥幼苗子叶的超过12844个细胞进行了scRNA-seq分析。利用一系列新的标记基因鉴定了11个细胞类群，主要对应于特定气孔发育阶段的细胞。对这些细胞类群中具有最高可变表达基因的比较分析揭示了调节叶肉和保卫细胞的发育，以及从原皮到保卫母细胞的分化的三个转录网络。研究者通过拟时轨迹分析研究了标记基因的动态发育过程，揭示了它们之间潜在的相互作用。几个新标记基因的鉴定提示气孔谱系细胞发育过程中新的调控机制。
材料及方法
子叶收集和原生质体制备
实验从5日龄的拟南芥幼苗子叶中分离出原生质体，通过浸没在溶液(0.5 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 5 mM MES, 1.5% Cellulase RS, 0.03% Pectolyase Y23, 0.25% BSA, actinomycin D [33 mg/L]和cordycepin [100mg/L], pH 5.5)中的幼苗收获子叶。然后将样品孵育4 h以分离原生质体。然后，用8%甘露醇缓冲液洗涤分离的细胞三次，以除去Mg2+。然后用40um的细胞过滤器过滤细胞。用台盼蓝染色检测细胞活性，用细胞计数器测量细胞浓度。
scRNA-seq文库制备及分析
scRNA-seq文库制备根据试剂盒提供的用户手册进行。利用Cell Ranger进行数据质控，在Seurat中对过滤后的矩阵进行库大小归一化，获得归一化的计数。采用主成分分析法对最易变基因进行降维。通过基于图形的方法对细胞进行聚类，并使用tSNE进行二维可视化。利用Monocle 2进行拟时轨迹分析。具有最高可变表达的基因被用于聚集细胞。然后将基因表达绘制为拟时函数，以跟踪拟时的变化，并沿着推断的拟时发育轨迹绘制了TF和标记基因。根据PlantTFDB数据库，用Cytoscape绘制了转录因子和靶基因的调控网络。利用Metascape进行DEGs的GO富集分析。
显微镜观察实验
利用激光共聚焦扫描显微镜观察萌发后5 d的子叶及绿色荧光蛋白荧光图像。
实验结果
气孔谱系细胞基因表达模式及细胞类型鉴定
本研究从使用t-SNE将细胞分成11个类群，之后选择有代表性的标记基因来鉴定每种不同的细胞类型(图1)。
图1、利用代表性标记基因的细胞类型鉴定。(A)标记基因在不同细胞类型中的表达示意图。(B)气孔发育过程中标记基因表达的动态模式分析。(C)根据每个细胞类群中标记物的表达模式鉴定细胞类型。
图2、每个聚类新标记基因的鉴定。(A)每个聚类中代表性标记基因表达的热图。(B)每种细胞类型中代表性标记基因表达小提琴图。
ATML1参与调节气孔谱系细胞的发育
为了探索分生母细胞（MMC）的潜在调节因子，实验分析了MMC中的标记基因，发现ATML1、PDF1、MUTE和SPCH具有高度相似的表达谱(图2A)。为了研究ATML1对气孔谱系细胞生物发生的影响，研究者使用ATML1突变体。结果发现，atml1-2和atml1-3植物在气孔谱系细胞的发育方面存在缺陷(图3A-F)。进一步的RT-PCR反应分析表明，SPCH和MUTE在atml1-2和atml1-3中的表达水平低于野生型(图3G)，表明atml1可以通过调节SPCH和MUTE的表达来调节气孔谱系细胞的发育。
图3、ATML1参与调节气孔的发育。(A-D)以atml1-2(Ler背景)、atml1-3(Col背景)
不同细胞类型富集基因的GO分析
为了研究在每种细胞类型中表达的基因的潜在生物学功能，研究者对所有细胞群进行了GO分析(图4)。结果显示，在不同细胞类型中鉴定的富集基因的数量及GO存在显著差异。
图4、不同细胞类型中表达基因的GO分析。(A)不同聚类中可变表达最高的基因的GO热图分析。(B) MMC、GMC、EM和LM细胞类群中基因GO热图分析。
不同细胞类型转录因子调控网络分析及鉴定
为了研究不同细胞类型发育的调节机制，研究者分析了每一种细胞类型中转录因子的调节网络，确定了最高数量的转移因子类型及在不同细胞中的异同（图5）。并且通过实验确定WRKY33、BPC蛋白参与了气孔细胞谱系发育（图6、图7）。
图5、不同细胞类型转录因子调控网络的鉴定。(A)不同细胞类型转录因子的鉴定。(B) MPC和PC细胞中转录因子的调控网络。(C) PC和GC细胞中转录因子的调控网络。(D) MMC、EM、LM和GMC细胞中转录因子调控网络。(E) PDC和 GMC中转录因子调控网络的分析。
图6、核心转录因子的特征图和功能分析。(A)不同聚类中代表性转录因子表达的特征图。(B)野生型对照WT和wrky33幼苗子叶气孔谱系细胞的发育模式。(C)根据(B)计算的细胞类型频率。
图7、BPC蛋白参与调节气孔的发育。(A)对BPC6-GFP亚细胞定位的分析。(B)SCRM和SCRM2在bpc六突变体中表达的qPCR分析。(C)5日龄bpc突变体和转基因植株子叶中气孔谱系细胞的发育模式。(D)根据(C)计算的细胞类型频率。(E)生长在MS培养基上的突变体的表皮细胞数。
标记基因表达的拟时发育轨迹分析
为了重建分化过程中的发育轨迹，研究者使用Monocle 2软件对scRNA-seq数据进行了拟时排序。总的来说，拟时路径有三个分支(图8A、B)。为了研究每个聚类中基因的拟时模式，实验对所有高表达基因进行了热图分析，所有基因的拟时模式可以分为三类(图8C)。之后在每个聚类中选择前5个标记基因来分析它们的拟时模式(图8D)。从热图和拟时曲线可以看出，SPCH、MUTE和FAMA的表达主要发生在PDC和MMC、MMC和M、GMC和GC细胞类型之间(图9)。
图8、类群和所选标记基因的拟时分析。(A)每个类群细胞在拟时轨迹上的分布。(B)根据类群标记着色的拟时轨迹。(C) 拟时进程中所有基因的聚集。(D)代表基因沿气孔谱系细胞拟时进程的聚集和表达动态分析。
图9、已知标记基因的拟时分析。(A)沿着气孔谱系细胞的拟时进程聚集代表性基因。(B)沿着代表性基因的拟时进程的基因表达动态分析。
实验结论
本研究利用scRNA-seq探讨了可追溯的、不可逆的气孔谱系细胞的命运决定过程，鉴定出不同分化细胞类型，并在不同的细胞类型中发现了一系列新的标记基因。实验还通过检查相应突变体子叶中的气孔发育模式，分析了一些标记基因对气孔谱系细胞发育的影响，并且分析了转录因子调节网络在调节气孔谱系细胞发育中的作用，探讨了气孔谱系细胞的发育拟时轨迹及其调控机制。
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