2019年10月m6A RNA甲基化研究总结

发稿时间：2019-11-13来源：天昊生物

2019年10月份m6A RNA甲基化方向共有15篇5分以上文章发表（Epub时间最早也在10月份），其中10分以上有10篇文章。值得一提的是多篇文章由中国科研团队完成！这15篇文章中2篇与病毒相关，2篇与植物相关，1篇与组织m6A甲基化图谱有关，1篇与红细胞生成相关，4篇news或letter形式文章，还有5篇与肿瘤相关（其中2篇胃癌m6A相关的文章应该是胃癌中仅有的2篇10分以上paper，分别由南京大学医学院附属鼓楼医院和上海交通大学医学院附属仁济医院的团队完成！）。

 

一、短文形式的文章

10月28日Nature Methods以news & views的形式再次介绍了2种RNA修饰的表征方法——DART-seq和m1A-IP-seq/m1A quant-seq（均在2019年Nature Methods上发表），研究人员改造了酶，并利用酶介导的突变特征在单碱基分辨率上map m6A和m1A，这样能够改善传统方法的局限性，如低的分辨率、高的样本起始量需求、高花费、繁琐的实验步骤、交叉反应和灵敏度等问题。

 

10月12日Cell Research以Letter形式介绍了m6A修饰能够促进共转录的R环形式以阻止Pol II通读活性，从而实现转录终止。敲降METTL3能够显著减少m6A+基因在转录终止位点（TESs）的R-loop积累，进而扰乱终止。TESs的R-loop恢复及通读活性的抑制需要METTL3的甲基转移酶活性。METTL3对R-loop及Pol II的调控影响表明额外的接头蛋白的存在，来实现桥接METTL3和Pol II的相互作用。因此需要进一步的研究揭示调控这种相互作用的蛋白，进而阐明潜在的机制。（中科院和清华团队）

 

10月22日复旦大学和同济大学团队参与的一项研究也发现在in vitro和in vivo的实验均证实m6A能够增强YTHDF2的相分离。尽管重组的YTHDF2本身in vitro条件下也可以发生相分离，但是m6A修饰显著增强了这种能力，而且in vivo实验中YTHDF2液状相分离可能是基于其结合到m6A修饰的mRNA分子上。而先前已有多个课题组（清华团队，康奈尔团队等）报道了YTHDF家族蛋白显示出相分离潜能受m6A修饰的mRNA影响。（详见链接：m6A领域热点与热点相结合）

 

这篇文章主要总结了m6A修饰在自身免疫病中的潜在作用，m6A的调控酶可能作为自身免疫病新的潜在治疗靶点，这些相关的研究均在2018-2019年完成，为自身免疫病的研究提供了新的思路。

 

二、m6A图谱

北大生科院伊成器教授课题组和复旦大学附属中山医院樊嘉院士课题组合作揭示了人和小鼠组织中m⁶A和m⁶Am甲基化图谱及调控作用。m6A（mRNA中最丰富的内部修饰）和m⁶Am（第一个转录核苷酸上的修饰）是两种可逆的表观转录组标记。然而，人和小鼠组织中的m⁶A和m⁶Am的特征及分布方式却鲜为人知。这篇文章报道了43种人组织和16中小鼠组织中的m⁶A和m⁶Am甲基化图谱，证实了脑组织具有最强的组织特异性。一小部分的组织特异性的m⁶A peaks可以很容易区分组织类型。m⁶A和m⁶Am的整体水平部分与其写蛋白或擦除蛋白的表达水平相关。另外，含有m⁶A的区域SNPs很丰富。物种间进一步的分析显示是物种而不是组织类型主要决定了甲基化。总体上，这项研究对于解析哺乳动物组织中m⁶A和m⁶Am的图谱及调控提供了深度的资源。

 

三、病毒

该研究发现人的呼吸道合胞体病毒（RSV）RNAs在关键区域被m6A修饰，而且这些修饰能够增强病毒的复制和致病。敲降m6A甲基转移酶降低了RSV复制和基因表达，而敲低m6A脱甲基酶则会有相反的影响。G基因转录本有最丰富的m6A修饰。重组的RSV变异体表达的G转录本缺乏特定的m6A簇，在A549细胞、原代分化良好的人呼吸道上皮细胞培养中及棉鼠呼吸道中显示出复制的减少。m6A缺陷的变异体之一在棉鼠中是高度减毒的，但是保留了高度的免疫原性。总体上，这些结果证明了病毒m6A甲基化增强了RSV的复制和致病，并且发现病毒m6A甲基化可以作为靶点，去合理设计候选的RSV或可能其他的肺炎病毒的减毒活疫苗。

 

这篇文章在卡波西肉瘤相关的孢疹病毒（KSHV）RNA分子ORF50中发现了来源于“皇室家族”（Royal family）7个成员可能作为m6A的读蛋白，包括SND1。利用RIP-seq和eCLIP（enhanced CLIP）分析表征SND1蛋白结合的转录组特征，显示SND1确实作为一个m6A reader蛋白。进一步证明了ORF50 RNA的m6A修饰对SND1结合至关重要，其反过来稳定了ORF50转录本。更重要的是，SND1敲除会抑制KSHV早期基因表达，说明SND1对KSHV的溶菌复制是必需的。因此这项工作证实了“皇室家族”的成员有m6A-reading能力，除了蛋白甲基化修饰，极大地增加了其表观上的功能。

 

四、植物

线粒体是ATP产生的主要场所，在很多对于细胞起决定作用的代谢过程中发挥重要作用。作为一种古老的细菌内共生体的残余物，线粒体含有自己的遗传物质（线粒体DNA，mtDNA）和一套蛋白合成的机器。植物中mtDNA的表达是复杂的，特别是在转录后水平上。在转录后，被细胞器核糖体翻译前，多顺反子pre-RNAs会经历广泛地修饰，包括裁剪、剪接和编辑。这项研究集中在植物线粒体的腺嘌呤核苷酸的m6A修饰，m6A是核编码mRNAs中主要的一种修饰方式。这种动态修饰的生物学重要性正在研究中，但是广泛接受的是m6A调控结构的转变进而影响RNA的稳定性和/或活性。对拟南芥和花椰菜线粒体进行m6A-RIP-seq实验，发现其中m6A修饰图谱的信息。结果显示m6A靶向多种不同的线粒体转录本类型，包括已知基因、mtORF及非编码RNA。非编码RNA会经历多样的m6A修饰，而mRNA中的m6A修饰似乎倾向于起始编码的位置，并且调控其稳定性。

 

N⁶-甲基腺嘌呤是真核生物mRNA中最丰富的修饰方式。尽管m6A已经被证实影响几乎所有方面的RNA代谢，但在植物中其对转录后翻译效率平衡的整体作用仍然未知。这项研究中科研人员对两株玉米自交系进行转录组范围内m6A分布和多聚核糖体分析实验，以评估m6A修饰和翻译状态的整体相关性。结果发现m6A位点广泛分布在多种蛋白编码基因中，只限于共有的基序（motif），主要富集在3’非翻译区，并且与可变的多聚腺苷酸化利用高度协调，这些说明m6A修饰在调控可变腺苷酸化位点的选择中具有重要作用。更为重要的是，发现m6A修饰显示出与翻译状态与多层面的相关性，主要基于其强度和遗传位点。而且，实验中观察到m6A修饰存在大量的种内的变异性，这种自然的变异部分由基因特异性表达和可变剪接所驱动。总体上，这些结果为确定玉米中受m6A修饰的转录本提供了宝贵的资源，而且为更好地理解自然的m6A变异在介导基因表达调控铺平了道路。

 

五、肿瘤

鼓楼医院团队主要研究METTL3在胃癌中的生物学功能和临床意义。主要研究成果如下：m6A RNA总体水平在胃癌中是显著增加的，而METTL3是m6A修饰主要的调控因素。METTL3的表达在胃癌组织中显著上升，并且与较差的预后相关。多元Cox回归分析显示METTL3表达水平可以作为独立的预后因素，能够有效地预测胃癌患者的生存。而且，体外和体内实验中METTL3的过表达均能够促进胃癌增殖和肝转移。机制上，P300介导的METTL3启动子区域H3K27乙酰化激活能够诱导METTL3转录，进而激发了HDGF mRNA的m6A修饰，并且m6A的reader IGF2BP3能够直接识别并结合到HDGF mRNA的m6A位点上，最终增强其mRNA稳定性。分泌的HDGF促进肿瘤血管生成，而核内的HDGF激活了GLUT4和ENO2的表达，进而增加了胃癌细胞的糖酵解，这些与随后的肿瘤生长和肝转移相关。总结以上结果，这项研究证实了上升的METTL3表达促进了胃癌肿瘤的血管生成和糖酵解过程，表明METTL3的表达是胃癌潜在的预后标志物及治疗靶点。

 

仁济医院的团队同样也是研究METTL3在胃癌中的重要作用。主要的研究方法和结果如下：利用qRT-PCR和免疫组化实验发现METTL3这一m6A甲基转移酶在胃癌中呈现上调；临床上，上升的METTL3水平显示有较差的预后。体外的实验表明METTL3对于肿瘤上皮间质转化这一过程是需要的；体内实验说明METTL3对于胃癌转移是需要的。通过转录组测序、m6A甲基化测序、MeRIP qRT-PCR、共焦免疫荧光实验、荧光素酶报告基因实验、共免疫沉淀、RNA免疫沉淀和染色质免疫沉淀实验等从机制上发现了胃癌细胞中METTL3介导的m6A修饰，并且发现了ZMYM1作为METTL3的一个真实的靶点。ZMYM1的m6A修饰增加其mRNA稳定性，主要基于读蛋白HuR依赖的通路。另外ZMYM1结合并调控了E-钙黏蛋白（E-cadherin）启动子区域的抑制，通过招募CtBP/LSD1/CoREST的方式，因而促进上皮间质转化程序和转移。总结以上结果，这项研究发现m6A修饰在胃癌中的关键作用，同时揭示了METTL3/ ZMYM1/E-cadherin信号通路作为胃癌抗转移策略的潜在治疗靶点。

 

中科院昆明动物所的科研团队近期的成果显示m6A的结合蛋白之一YTHDF1与低氧适应和非小细胞肺癌（NSCLC）进展有关。低氧自然发生在高海拔地区，病理上主要发生在低氧性实体瘤中。这项研究报道了参与多种人类癌症的基因在藏族人和6种西藏驯养动物中比相应低地的进化更快。此外，m6A修饰的mRNA结合蛋白YTHDF1，一个进化上积极选择的高原适应基因在包括NSCLC在内的多种肿瘤中被扩增。结果显示YTHDF1的缺陷能够抑制NSCLC细胞增殖和异种移植肿瘤的形成，通过调控CDK2, CDK4和cyclin D1的翻译效率；而且YTHDF1的缺失从头（de novo）抑制了肺腺癌的进展。然而，实验观察到YTHDF1的高表达与更好的临床效果相关，因其缺失会导致癌细胞对铂化合物化疗产生耐药。机制研究发现Keap1-Nrf2-AKR1C1信号轴是YTHDF1的下游调控因素。总结来看，这些发现为揭示YTHDF1在低氧适应和非小细胞肺癌进展的关键作用提供了依据。

 

中山大学肿瘤防治中心谢丹、徐瑞华等课题组发现环状circNSUN2的m6A修饰促进其出核转运，稳定期下游HMGA2从而促进结直肠癌肝转移。这篇文章首先发现circNSUN2在结直肠癌伴有肝转移患者的肿瘤组织和血清样本中呈现表达上调，并且预示了较差的预后。In vivo实验证实了circNSUN2在PDX转移瘤模型中促进了肝转移的发生，并且体外实验也验证了其促进癌细胞侵袭。更重要的是circNSUN2的m6A修饰促进其出核转运，通过在细胞质中形成circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2这样一个三元RNA-蛋白复合物，circNSUN2能够增强HMGA2的稳定性从而促进结直肠癌的转移进展。临床上，circNSUN2和HMGA2表达水平的上调在肝转移组织样本中比原发的结直肠癌组织更加显著。这些发现表明circNSUN2可以作为结直肠癌的预后标志物，同时可能成为未来的潜在治疗靶点。（非编码RNA m6A修饰详见链接：2019国自然最全m6A RNA甲基化解析）

 

中山大学团队的这项工作也是揭示的结直肠癌中长链非编码RNA和m6A修饰之间的功能机制。YAP激活对于包括结直肠癌在内的肿瘤发展至关重要，然而在癌症进展中m6A修饰的lncRNA是否可以调控YAP的激活仍然未知。因此，研究人员利用RIP-seq、RNA FISH、免疫荧光染色及生化实验方法发现lncRNA GAS5能够直接与YAP的WW结构域相互影响，进而促进内源的YAP核质转运，并且促进其磷酸化及随后的泛素化介导的降解，最终在体外和体内抑制结直肠癌进展。同时证实了YTHDF3不仅是YAP的新的靶点，而且在YAP信号通路中具有重要作用，主要通过促进m6A修饰的GAS5降解，这对了解结直肠癌的进展可能是一个新的思路。临床上，结直肠癌患者肿瘤中lncRNA GAS5的表达与YAP和YTHDF3蛋白的水平呈负相关。（非编码RNA m6A修饰详见链接：2019国自然最全m6A RNA甲基化解析）

 

六、红细胞生成

控制红细胞特化、成熟和相关疾病的很多调控特征仍然是个谜。为了发现红细胞生成新的调控因素，研究人员利用功能基因组筛选那些影响红细胞marker CD235a/GYPA表达的基因。在这些靶点的验证中包括编码m6A甲基转移酶复合物的基因，包括METTL14, METTL3和WTAP。结果证实了m6A甲基转移酶活性能够促进红细胞基因表达程序，是通过选择性翻译约300个m6A修饰基因的方式，包括那些编码SETD组蛋白甲基转移酶、核糖体元件及polyA RNA结合蛋白的基因。显著的是，m6A标记的消失会导致关键的红细胞特定KLF1转录靶点上H3K4me3标记的消失。更进一步地，每个m6A甲基转移酶亚基和其部分mRNA靶点对于初级的骨髓来源的祖细胞中红细胞特化必需的。因此，m6A mRNA标记促进了人红细胞生成中需要的一些基因的翻译。

 

天昊生物

天昊生物具有多年基因组、转录组和表观组等多组学检测与分析的经验，m6A RNA甲基化作为表观领域的一大热点，天昊生物可为您提供m6A整体水平定量，结合RNA-seq和m6A MeRIP-seq挖掘潜在的受m6A调控酶影响的靶点，同时可对靶点进行MeRIP-qPCR验证。生信团队亦可提供个性化的数据库挖掘与生信分析内容。

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