6个样本全转录组测序，轻松斩获4.2分文章

发稿时间：2019-10-17来源：天昊生物

当你手中有好的实验材料时，从全转录组（mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA）角度入手，不失为一种高效的研究策略。刚刚在上月发表的一篇文章，就利用该策略系统阐述了油菜细胞质雄性不育系花药发育中的circRNA表达模式及ceRNA和miRNA-mRNA间的调控网络。

发表期刊：Int. J. Mol. Sci.  发表时间：2019-9-27  影响因子：4.183

植物的雄性不育，是指它们不能产生正常功能的花粉粒。细胞质雄性不育是一种重要的植物繁殖特性，可作为开发作物杂种优势的有用工具。之前研究发现了一些mRNA和miRNAs可以作为细胞质雄性不育系统的重要调节因子。环状RNA(circRNA)是一类新型共价闭合的单链内源性非编码RNA，也可以通过竞争性内源RNA(ceRNAs)调控机制，参与转录后调控过程。

在本文中，研究者在油菜上建立了细胞质雄性不育系（sterile line）Bcpol97-05A和可育系（fertile line）Bcah97-01B，通过全转录组测序对不育系和可育系共6个样本（2类样本各3次重复）的花蕾进行了RNA表达谱比较，共鉴定出31个差异表达的circRNAs、47个差异表达的miRNAs和4779个差异表达的mRNAs (注：本文未提到lncRNA相关信息，小编估计是作者发掘到很多感兴趣的候选lncRNAs，留到后续研究)。利用上述结果，构建了miRNA介导的调控网络和ceRNA网络，推测circRNA A02:23507399|23531438是在转录后水平调控花药发育的重要circRNAs。GO分析表明，miRNAs和circRNAs可以调节纤维素、孢粉素、果胶和胰蛋白酶的有序分泌和沉积；脂质的及时降解；绒毡层细胞的程序性细胞死亡在花药发育中起着关键作用。本研究揭示了一个新的circRNA-miRNA-mRNA网络，它参与了油菜花药的发育，丰富了对开花植物细胞质雄性不育的理解，为进一步研究circRNA和miRNA在花药发育中的作用奠定了基础。

实验材料及方法

本文材料为油菜雄性不育系Bcpol97-05A，其保持系为Bcajh97-01B。开花后，鉴定可育和不育植物，将单株植物花序进行取样，液氮速冻后-75℃保存。利用Trizol提取花序的总RNA。全转录组分析的总RNA来自每个株系30棵单株植物的混合，共三个生物重复。在验证了RNA样品的质量后，使用epicentre Ribo-Zero试剂盒去除rRNA，之后分别构建各类RNA文库。构建好文库并质控后，利用Illumina Hi-Seq平台进行测序。使用find_circ等软件预测circRNA。通过与miRBase中成熟miRNAs的序列进行比对来鉴定已知的miRNAs。使用miRDeep2软件预测了新的miRNAs。后续还进行了目标基因预测、GO分析和目标基因的KEGG分析等，并进行了qRT-PCR验证，最终利用Cytoscape构建miRNA-mRNA和circRNA-miRNA网络。

实验结果

油菜细胞质雄性不育系的建立

本实验以可育植株Bcajh97-01B为轮回亲本，回交八代选育不育系，最终建立了雄性不育系Bcpol97-05A，其保持系为Bcajh97-01B。与可育系相比，Bcpol97-05A的雄蕊似乎已经耗尽了色素，呈现出白化的样子。它们也枯萎了，没有成熟的花粉粒。此外，不育系Bcpol97-05A的雄蕊似乎较短，并显示出相连的花药(图1)，其花粉的活力比可育系低，约85%的花粉粒是败育的(图2A，B)。DAPI染色，也发现不育系的花粉形态异常，核发育异常(图2C-F)。实验还观察了两个品系花粉发育的表型特征。不育系的花药囊比可育系的小，最终成熟花粉粒比可育系中少得多(图3)。

图1、油菜可育系和不育系花的形态

图2、油菜可育系和不育系的花粉特性

图3、油菜可育系和不育系的花药横切面

不育系和可育系circRNA的鉴定

通过全基因组测序，研究者从雄性不育系和可育系的花蕾中鉴定并注释了1443个circRNAs。共有121个circRNAs (图4A)。其转录本广泛分布在所有10条染色体中(图4B)。大约12.68%的circRNAs来自chr3，10.46%来自chr6，14.00%来自chr9，而来自其他染色体的circRNAs的百分比都小于10%(图4C)。circRNAs分为三类，其中外显子环状911个(63.13%)，内含子circRNAs 182个(12.61%)，外显子内含子circRNAs 350个(24.26%；图5A)，其中大部分长度为200-400 bp(图5B)。

图4、油菜可育系和不育系中鉴定的circRNA

图5、油菜可育系和不育系中circRNA特征

可育系与不育系中差异RNAs的鉴定

本研究在不育系中鉴定出31个DEcircRNAs (9个上调和22个下调)和47个DEmiRNA (6个上调和41个下调)。我们分别在表1和表2中总结了基于log2FC的前10个脱氧核糖核酸和核糖核酸。此外，与可育系相比，研究者在不育系中检测到4779个DEmRNAs(1021个上调和3758个下调)。

表1、与油菜可育系和不育系中差异表达的前10位circRNAs

表2、油菜可育系和不育系差异表达的前10位miRNAs

对DEmRNAs的KEGG途径富集分析表明，“淀粉和蔗糖代谢”、“苯丙素类生物合成”和“戊糖和葡糖醛酸相互转化”是最富集的代谢途径。研究还表明，大多数脱氧核糖核酸都被注释为与植物激素信号转导有关(图6)。

图6、油菜可育系和不育系差异表达基因的KEGG途径富集分析

此外还对DEmRNAs进行了GO分析，分析了差异基因和所有基因二级功能的富集，反映了每个二级功能的状态(图7)。此外，我们分析了每一个GO术语的富集情况，并总结了在“生物过程”类别、“细胞成分”类别和“分子功能”类别中最显著富集的GO术语。在BP类别中，最重要的三个节点是植物型细胞壁修饰、花粉管生长和肌动蛋白丝基运动。大多数差异基因参与花粉壁发育，包括花粉外壁和胞质形成(表3)。

图7、油菜可育系和不育系差异基因GO分析

表3、油菜可育系和不育系差异表达基因的BP类别前10位

此外，研究者使用相同的不育系和可育系样品，通过qRT-PCR证实了核糖核酸序列的结果。随机选择五个circRNAs、八个miRNAs和八个mRNAs。定量的结果与测序结果一致，这证明了RNA图谱的高度可靠性(图8)。

图8、RNA测序数据的qRT-PCR验证

2.4 .半核糖核酸-半核糖核酸网络的构建

为了更好地理解雄性不育花药发育过程中的基因调控网络，本研究使用TargetFinder软件鉴定了推测的DEmiRNA–DEmRNA相互作用。结果总共获得了170个DEmiRNA–DEmRNA相互作用。我们选择了18个miRNAs和37个mRNAs的DEmiRNA–DEmRNA对，其中miRNAs和相应的mRNAs具有相反的表达，并利用Cytoscape构建了miRNA介导的调控网络(图9)。为了研究miRNAs的潜在功能，对该网络中假定的靶基因进行了GO分析(图10)。

图9、油菜可育系和不育系花药发育中的DEmiRNA-DEmRNA网络图

图10、油菜可育系和不育系DEmiRNA-DEmRNA网络中miRNAs潜在靶标的GO分类

DEcircRNA–DEmiRNA–DEmRNA网络的构建

通过TargetFinder软件，在不育系中获得了两个由一个上调的circRNA(A02:23507399|23531438)和两个下调的miRNA(非保守_A02_5092和非保守_A07_27586)靶基因组成的DEcircRNA–DEmiRNA相互作用。为了研究ceRNA在花药发育中的调控，并鉴定与花药发育相关的circRNA，构建了DEcircRNA–DEmiRNA–DEmRNA网络。最终，通过分析，构建了一个ceRNA网络，由一个circRNA、两个miRNAs、五个mRNAs(Bra006799、Bra013352、Bra022668、Bra029377和Bra038700)和10个交互对组成(图11)。

图11、油菜可育系和不育系花药发育中的决定DEcircRNA-DEmiRNA-DEmRNA三重网络

结论

本研究通过全转录组测序，鉴定了几种与花药发育相关的RNAs，包括mRNA、circRNA和miRNA，还重建了涉及这些RNA分子的假定调节网络，这将加深和丰富人们对花药发育和雄性生育控制的理解。此外，对ceRNA网络的解析，为花药发育过程中RNA的调控作用提供新的视角。

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全转录组测序技术优势：

• rRNA去除建库，保留了完整的RNA种类信息；
•  链特异性文库，可以保留转录本的链信息，更准确地检测反义RNA；
• 使用高通量测序，能够获得更加全面的RNA信息，包括低丰度的RNA；
• 通过测定的序列信息精确地分析不同类型RNA的表达丰度变化及其生物学功能；
• 分析同一样本中的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA四种类型RNA，明确这些RNA之间的共表达和调控关系，揭示ceRNA调控机制。

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