经典的m6A RNA甲基化研究案例

发稿时间：2019-08-20来源：天昊生物

文章标题：METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma

发表杂志：Molecular Cancer

影响因子：10.679

发表时间：2019年6月

 

中山大学肿瘤防治中心徐瑞华教授和鞠怀强教授团队在结直肠癌（CRC）中发现METTL3能够基于m6A-IGF2BP2的机制促进肿瘤进展。鉴于结直肠癌中并未有太多关于m6A RNA甲基化修饰的报道，本研究首次在结直肠中证实了METTL3促癌的功能。

 

主要研究结果

 

1. METTL3在转移性CRC中高表达且与不良预后相关

首先在TCGA数据库中发现多个m6A相关‘写蛋白/擦除蛋白/读蛋白’的表达水平在结肠癌中异常表达(Fig.1a)，qPCR验证了其表达水平(Fig.1b)。由于METTL3在多个癌种中被证实高表达，进一步验证发现METTL3在复发性CRC组织和转移性肝组织也呈现表达上调(Fig.1c)，而且mRNA和蛋白水平在CRC细胞系也显示上调(Fig.1d-e)。

METTL3蛋白水平在CRC患者中表达上调(Fig.1f)，免疫组化结果验证了METTL3在CRC组织、淋巴结和肝转移组织中都显示出高表达(Fig.1g-h)。更重要的是，METTL3高表达的患者化疗效果更差(Fig.1i)，整体生存率和无病生存率更低(Fig.1j)。

 

2. SOX2受METTL3介导的m6A修饰调控

METTL3在SW620细胞中显示比SW480中具有更高的表达（两种细胞系具有不同的转移潜能，Fig.2a），然后利用MeRIP-seq和RNA-seq在SW480、SW620和METTL3敲降的SW620细胞中寻找潜在的靶点。综合分析差异的甲基化peak和表达水平，发现与SW480细胞相比，SW620细胞中733个高甲基化peak同时具有更高的表达水平；在敲降的细胞中3393个低甲基化peak具有更低的表达水平(Fig.2b)。从这两组结果中发现192个特异性的peak被共享(Fig.2c)，与158个基因相关，通路富集发现这些可能参与干细胞分化的通路中(Fig.2d)。

进一步对候选的基因分析发现四个基因SEMA3A、BCHE、ZFP36L2和SOX2在SW620细胞中显示出m6A修饰的大幅增加，而在敲降细胞中显示一致的减少(Fig.2e)。然而m6A-qPCR实验证实SOX2的m6A水平在敲降细胞中下降得最显著，因此SOX2可能作为METTL3的潜在靶点参与到促进CRC干性和转移过程中(Fig.2f-h)。

 

3. 体外实验证实METTL3促进CRC细胞干性

在METTL3敲降的SW620细胞中球体数目(Fig.3a-b)、菌落形成、侵袭能力均受影响(Fig.3c)，而对奥沙利铂的化疗敏感性增加(Fig.3d)，癌症干细胞表面抗原CD133、CD44和EpCAM在METTL3被抑制后显著下降(Fig.3e)，同时METTL3下游基因也被显著抑制(Fig.3f)，另外SOX2过表达能够rescue干性下降的表型(Fig.3g-i)。这些结果表明METTL3在CRC细胞中的致癌的角色，主要通过维持SOX2的表达实现促进肿瘤的自我更新、细胞侵入和化疗抗性。

 

4. 体内实验证实METTL3驱动CRC肿瘤发生和转移

通过异种移植实验发现METTL3敲降的细胞移植后肿瘤生长速率下降、肿瘤体积减小(Fig.4a-b)；免疫组化发现尾静脉注射对照组SW620细胞的小鼠会出现更多的肺转移结节(Fig.4c)。同样地，SOX2过表达能够rescue肿瘤形成的功能(Fig.4d)。利用PDX模型瘤内注射siRNA评价METTL3的治疗作用，主要结果也与上述一致(Fig.4e-h)。因此，体内实验确实证实了METTL3在CRC中的成瘤和转移作用。

 

5. IGF2BP2基于m6A修饰的方式增加SOX2 mRNA稳定性

先前有研究发现两类m6A读蛋白（readers）家族可能控制着甲基化修饰的mRNA的命运，如YTH家族和IGF2BP家族。为了揭示SOX2特定的m6A readers，利用链霉亲和素RNA pull down实验检测相关的readers，发现IGF2BP2特异性地结合在SOX2全长转录本上，而非IGF2BP家族其它成员或YTH家族(Fig.5a)。而且pull down实验也证实了IGF2BP2主要结合在CDS区，在motif缺失后特定的结合也会受到影响(Fig.5b)。RIP实验同样地证实了IGF2BP2和SOX2 mRNA之间直接的影响(Fig.5c)。

在抑制IGF2BP2后SOX2蛋白和mRNA水平、SOX2下游基因表达水平均受到显著抑制，IGF2BP2和SOX2转录本之间的作用也会受到METTL3的影响(Fig.5d-h)。在抑制METTL3或IGF2BP2后，SOX2 mRNA表达水平开始下降，而且其半衰期显著变短(Fig.5i-j)。这些结果都能说明IGF2BP2确实充当reader的角色，维持SOX2转录本的稳定性。

 

6. METTL3/SOX2/ IGF2BP2在CRC中的临床相关性

基于以上机制的发现，利用临床样本分析METTL3/SOX2/IGF2BP2之间的相关性，包括免疫组化实验、表达相关性，利用三个marker的IHC数据对CRC患者进行预后的预测，三者的高表达显示了最差的预后，因此可以建立一个很好的预测模型(Fig.6)。

 

 

研究总结

本研究发现了METTL3对于CRC进展的关键作用及可能基于m6A的机制，METTL3-IGF2BP2-SOX2之间的调控作用是基于m6A这一表观调控机制来实现的，另外PDX模型显示METTL3作为潜在靶点可能具有一定的治疗作用。

 

 

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