Nature Plants：靶向DNA甲基化抑制拟南芥开花基因座FLOWERING LOCUS T（FT）的增强子

发稿时间：2019-03-14来源：天昊生物

植物DNA甲基化一直是表观遗传学研究的热点领域。3月4日刚刚发表在Nature Plants上的文章，就巧妙的利用了反向重复序列（IR）转基因的方法，定向提高了目标区域DNA甲基化水平，达到了调控下游基因表达的目的，为表观调控研究提供了新的思路和方法。

FLOWERING LOCUS T（FT）在长日照下调控拟南芥开花过程中起着重要作用。FT在叶片中的表达取决于转录起始位点(TSS)上游5 kb远端转录增强子Block C。研究人员表达Block C的反向重复序列（IR）来诱导局部DNA甲基化和异染色质形成，导致诱导光周期中FT表达下调。利用靶向DNA甲基化作为工具来研究FT基因座的未知调控区域，研究者将位于基因下游1 kb的Block E鉴定为FT的新增强子。分析发现Block C和Block E在十字花科中是保守的，位于可接近的染色质中，充当加性转录增强子。其与近端FT启动子结合，控制FT表达来完成对光周期的响应。

转录增强子是多种转录因子的结合平台。增强子被证明与目标基因的启动子有物理上的相互作用，在那里它们参与转录因子等的招募。到目前为止，与动物中的增强子相比，植物中的增强子相对较少。

在植物中，从头合成的DNA甲基化是通过RNA依赖的DNA甲基化(RdDM)途径建立的。根据该机制，利用反向重复序列(IR)表达产生的双链RNA，被直接加工进入RdDM途径，从而对特定区域进行靶向DNA甲基化，这提供了一种通过转录基因沉默(TGS)来改变基因活性的方法。在拟南芥中，IR介导的TMM和FT启动子的DNA甲基化诱导了TGS。在这里，本研究了证明IR介导的DNA甲基化可以抑制远端调控区的活性，使人们能够发现新的调控区，并研究它们在天然基因组环境中对基因表达的影响。

实验方法

目标区域DNA甲基化克隆测序、ChIP-qPCR、小RNA测序、GUS组织化学染色等。

实验结果

IR诱导转基因植株晚花

在哥伦比亚(Col-0)野生型拟南芥背景(WT)中产生表达Block C IR靶向Block C处DNA甲基化，并评估转基因株系对FT表达的影响 (图1a，b)。在强FT诱导的长日照(16 h light/8 h黑暗)和中等诱导的日照条件(12 h light/12 h黑暗)下，评估每一代的开花时间。为了比较不同世代的开花时间，在等日照条件下，每一个株系同时生长四代( T3至T6)。与野生型相比，转基因株系的开花明显延迟，而非转基因株系的开花略有延迟(图1c)。在长日照条件下，检测了T3代和T6代的四个株系的FT表达及对应于它们各自的开花表型。转基因株系no.15-2和no.27-4的FT表达显著降低，而非转基因株系no.15-3和no.27-3并没有 (图1e)，说明IR靶向Block C的存在与诱导光周期的延迟开花和FT表达减少明显相关。

图1、Block C IR转基因植物出现花期延迟和FT表达下调现象

DNA甲基化和异染色质形成在Block C被诱导

先前的研究表明，DNA甲基化介导的TGS需要24-nt的小RNA(smRNA)。IR的表达产生dsRNA，其可由DICER LIKE 3 (DCL3)处理后整合进入RdDM路径。研究者在T6代对转基因和非转基因株系的smRNAs进行测序，发现smRNAs仅在转基因株系中特异性地定位到IR靶向区域。因此，产生smRNA需要IR的存在，这仅限于IR茎环的内部400bp (图2a)。定位到的IR目标区域主要为21-nt长smRNA，接着是22-nt和24-nt smRNA(图2b)。转基因株系no.27-4产生的smRNAs是株系no.15-2的大约7倍，但是FT表达的减少在这两个株系中是相当的，表明该途径中smRNAs是饱和的(图2a，b)。

研究者之后用亚硫酸氢盐处理来检测Block C的DNA甲基化水平，证实了之前报道的Col-0野生型幼苗中Block C不存在DNA甲基化(图2c)。在转基因株系中，DNA甲基化在包括Block C的IR靶区被诱导。利用DNA甲基化克隆测序（至少10个克隆/位置）的方法，检测了单胞嘧啶位置上DNA甲基化水平从10%到100%不等(图2c)。DNA甲基化也在IR靶区两侧100 bp检测到，尽管没有smRNAs定位到这些区域(图2c)。为了评估DNA甲基化的扩散范围，选择位于Block C和FT TSS之间的300bp区域作为对照。在对照区没有观察到DNA甲基化，表明DNA甲基化没有从Block C向FT的TSS扩散。之后比较了T3代和T5代的DNA甲基化水平，发现CG甲基化在两个转基因株系中得以维持，在非转基因株系中维持的程度要低得多，no.15-3株系为约10 %，no.27-3株系极少。在没有转基因的情况下CG甲基化从T3代维持到T5代(图2d)。CHH甲基化在转基因株系中随着世代的进展而降低，而在非转基因株系no.15-3和no.27-3中几乎为零(图2d)。总的来说，这些结果表明，IR丢失时，CG甲基化得到部分维持，维持水平因株系而异。

甲基化的DNA可以招募组蛋白甲基转移酶KYP，这将组蛋白H3的赖氨酸K9二甲基化(H3K9me2)，导致染色质致密化。H3K9me2反过来又分别招募环境中的CMT2和CMT3来促进CHH和CHG的DNA甲基化。本研究使用染色质免疫沉淀(ChIP)检测了IR诱导的DNA甲基化是否导致H3K9me2在Block C沉积。在两个独立的实验中，与野生型相比，转基因株系中H3K9me2水平增加，而非转基因no.15-3株系没有观察到增加(图2e)。

图2、在含有IR转基因植物中Block C区域 DNA被甲基化

FT由下游增强子Block E调节

由于IR靶向Block C造成其DNA甲基化，进而下调了FT表达，本实验用这种方法检测了可能参与FT表达的其他区域(图3a )。研究者为先前识别的Block B和一个被描述为Col-0插入区域设计了IRs，该区域存在于大约25 %的拟南芥材料中(图3a)。基于前人3C数据，这些区域对应于显示与近侧FT启动子相互作用的两个不同区域。DNA甲基化以前在Block B没有报道过，而Col-0插入显示带有甲基化。IRs的表达诱导Block B的DNA甲基化，导致Col-0插入处CHG和CHH的甲基化增加 (图3b)。尽管对于表达IR靶向Col-0插入区的植物，检测到FT表达没有统计学上的显著差异(图3c)，但检测到轻度但显著的后期开花表型(图3d)。

通过系统发育分析，通过分析更多十字花科物种的直系同源序列。位于FT下游1 kb的600 bp位置，命名为Block E，在所有序列中高度保守(图3a)。除了系统发育外，Block E和Block C都位于极易接近的染色质上(图3a)。进一步的分析显示，Block E和Block C共享几个与潜在TFBSs重叠的超保守区域，例如一个I盒、一个RE-alpha盒和两个CCAAT盒。此外，区块包含G盒( CACGTG)， ChIP-seq数据发现其与光敏色素相互作用因子4 (PIF4)的结合峰。

研究者设计了一个IR来靶向Block E，并测试DNA甲基化积累是否会像Block C一样影响开花时间(图3a)。与野生型相比，Block E IR的表达统计上显著延迟了开花时间(图3e)。与开花时间的延迟一致，在表达针对Block E的IR的转基因系中，FT表达减少(图3f)，这与所有序列DNA甲基化的增加(图3b)相关。

为了研究两个远端调控区之间的遗传作用关系，研究者检测了IRs Block E和Block C间F1杂交的开花时间，F1植株开花的时间明显晚于亲本。总的来说，这两个调控区域在调节开花时间方面起着加性作用(图3g)。

图3 、Block E是位于FT下游的一个新的调控元件

Block E和Block C增强了FT启动子的光周期编码响应

考虑到Block E和Block C共有的TFBSs数量，研究者检测了Block E稳定转化报告基因株系中的顺式调节功能。之前报道表明，与Block A融合的Block C，而不是单独的Block A，可以使叶片中GUS的表达。Block E正向和反向融合到FT区(Block A)或NOS启动子上。尽管Block C显示仅当与Block A融合时驱动GUS表达，框Block E能够用两种最小启动子驱动GUS表达(图4a)。

为了评估阻断Block E在对光周期的反应中是否调节了表达，实验比较了在短时间内连续生长的3 周幼苗和2天转换到长时间后的幼苗之间的报告基因表达。我们只使用了反向方向的Block E的结构植株，因为这些植株给出了最强的信号。通过对样品进行GUS转录的qRT-PCR分析。结果显示在长时间条件下，包含与Block A的融合的Block C或Block E有明显的诱导作用，而与minNOS的融合没有反应(图4b)。