Atmospheric Environment：对真菌气溶胶种群进行相对丰度和绝对丰度比较研究

发稿时间：2019-02-27来源：天昊生物

 

英文题目: Combining real-time PCR and next-generation DNA sequencing to

provide quantitative comparisons of fungal aerosol populations

中文题目：结合qPCR和二代测序对真菌气溶胶种群进行定量比较

期刊名：Atmospheric Environment

影响因子： 3.708

 

研究摘要

我们调查了春季和秋季收集到的以色列新罕布什尔州室外空气样本的真菌群落。利用二代测序（ITS）对真菌群落进行了解析。为了更定量地比较人体中的真菌暴露，将特定真菌分类群的相对丰度值（二代测序）乘以样本的真菌孢子总量（来源于通用真菌的qpcr），从而转化为绝对丰度。接下来，将Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, Epicoccum nigrum, Penicillium/ Aspergillus spp.由此得到的绝对丰度与这四个分类群特异引物定量PCR得到的绝对丰度进行比较。这些比较结果表明：1）由相对丰度值（二代测序）乘以样本真菌孢子总量（通用真菌qpcr）产生的绝对丰度与来自物种特异性引物定量PCR得到的绝对丰度密切相关（对于所有四个物种，p<0.005，所有R>0.70）, 对于浓度较高的物种，相关系数较大；2）我们的微生物气溶胶种群分析表明，春季的真菌多样性（OTU数量）高于秋季（p=0.02），主坐标分析显示，类群分布存在明显的季节性差异（ANOSIM p=0.004）；3）在致敏和/或致病菌属中，Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Cladosporium的绝对丰度在秋季更高，而Cryptococcus, Penicillium, and Ulocladium绝对丰度在春季更高。将二代测序得到的真菌相对丰度数据转化为绝对丰度，可以改善基于二代测序的定量气溶胶暴露评估。

研究背景

二代测序技术引入到环境科学中从而加强了对室内空气和大气样本中微生物种群的探索。最近的研究为大气中真菌种群的多样性提供了新的信息，使人们对室内真菌气溶胶（由固体或液体小质点分散并悬浮在气体介质中形成的胶体分散体系）的来源有了更深入的了解，使用这些遗传方法有望将真菌气溶胶种群和人类健康影响联系起来。基于DNA序列的方法避免了与培养相关的显著多样性偏差，因此可以检测可能对健康或环境造成影响的不可培养真菌或真菌孢子。此外，二代测序因其高通量，因此可以深入提供关于真菌种群的多样性信息。真菌DNA的内转录间隔区（ITS）被认为是鉴定真菌的主要条形码标记，由于其高变异性以及二代测序长度可以囊括ITS1和ITS2两个区域，因此可以用于识别不同分类水平的物种。

大气气溶胶样品中真菌ITS序列分析的中心输出数据是一个分类群列表，其报告了样本中不同的种、属或其他分类群占所产生总序列数的百分比，即相对丰度。然而，对于不同的样品，大气样品中的总真菌丰度通常是不同的，因此，特定物种的相对丰度值并不能对不同气溶胶样品之间进行有意义的定量比较，例如，两个样品，每个样品由25%的枝孢霉属组成，但在真菌孢子总数则有10倍的差异，那该属的绝对量上也有10倍的差异。因此为了定量地解释总真菌种群的这些变化，必须通过将相对丰度乘以样本真菌孢子总量，从而将相对丰度值转化为绝对丰度。

本研究的目的是确定将总真菌量与特定类群相对丰度相乘得到的绝对值是否能准确反映这些特定类群的绝对丰度。我们利用在以色列Rehovot上空采集的季节性PM10样品经过罗氏454测序得到的真菌ITS序列来鉴定不同的大气真菌种群。然后，将四个选定真菌类群（Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, Epicoccum nigrum, Penicillium/Aspergillus spp.）的相对丰度乘以由通用真菌引物定量PCR生成的总真菌量，并将由此得到的绝对丰度与这四个分类群特异引物定量PCR得到的绝对丰度进行比较，将相对丰度转换为绝对丰度可显著提高空气中真菌的准确测量能力。

研究对象

空气样本是在石英纤维过滤器上采集的，该过滤器放置在高容量PM₁₀采样器中，该采样器位于以色列Rehovot一座四层建筑顶部。由于以色列位于欧洲、亚洲和非洲交汇处，受沙尘暴、交通和风的影响，真菌气溶胶和过敏原的数量预计将随季节变化。采样后，过滤器存储在-20度直到进一步分析。共有13个样本被收集，其中包括3个生物重复（Biological replicates）。通过对从过滤器中提取的相同核酸进行种群分析，也产生了3个技术重复（Technical replicates）。春季样品包括4月和5月的六个单独采样日期，秋季样品包括9月的三个不同采样日期，1月采集了一个冬季样品。此后，1月份采集的样品称为“冬季”样品，4、5月份采集的样品称为“春季”样品，9月份采集的样品称为“秋季”样品。采样数据和气象信息是见表1。

 

表1样本汇总、天气条件和多样性值

研究结果

共有22854个序列通过了质控，每个样本的平均序列数为1428个（范围692-2370）。所有样本共鉴定出2488个OTU。样本A的多样性指标是通过样本中随机选取的650条序列chao1和香农多样性指数（表1）来估计的，稀疏曲线如图1a所示。根据样本，chao1预测了268-1210个OTU，这与之前在美国加利福尼亚州北部和美国东北部的室外空气中描述的丰富程度相似。比较重复样本，技术重复的OTU丰富度的累积变异系数为5.9%，生物复制的累积变异系数为12%。同时测定了真菌种类绝对浓度的重现性。在物种等级上，技术重复(R =0.991)比生物重复(R =0.966)具有更高的重复性（图1C和D）。

 

图1技术重复和生物重复物种相对丰度的稀释性曲线和重复性比较

二代测序和特异性引物qPCR分别得到的物种绝对丰度比较

通过qpcr分析，测定了前一项研究中所有真菌, A. alternata, A. fumigatus, C. cladosporioides, E. nigrum, Penicillium group 3, Penicillium/Aspergillus的绝对丰度，前一项研究集中关注这些相同气溶胶样品的麦角固醇含量。二代测序的绝对丰度值=每个样本特定分类群的相对丰度乘以真菌孢子总量（用通用真菌引物的qpcr测量）（A _taxon=R _taxon*F _qPCR）。结果发现这些来自二代测序的绝对丰度与来自物种特定引物qpcr的绝对丰度相关（图2）。当所有四个分类群被一起考虑时（p<0.0001，R=0.86, 图2），或当单独考虑特定分类群时（所有p<0.005，所有R>0.70，图3），这些相关性都很强。对于丰度较高的物种，相关系数较高（图2b）。

 

图2 来自二代测序的绝对丰度与来自物种特定引物qpcr的绝对丰度相关性分析

 

图3 四个真菌分类群来自二代测序的绝对丰度与来自物种特定引物qpcr的绝对丰度相关性分析

真菌群落的季节性差异

在所有的季节中，Cladosporium是最丰富的属，dothidomycetes是最丰富的纲，而Ascomycota是最丰富的门，真菌群落的总体多样性和分类组成随季节而变化，春季真菌丰富度（OTU数）高于秋季（P<0.02）（图1a和b）。使用Morisita Horn非系统发育距离对微生物种群进行主坐标分析，结果显示真菌群落按季节的分离具有统计学意义（图4）。

 

 

图4使用Morisita Horn非系统发育距离对微生物种群进行主坐标分析

相对丰度和绝对丰度的差异反映在门水平（图5a和b）。相对丰度分析表明，在春季Basidiomycota的数量相对秋季较丰富（P<0.03），而在秋季，Ascomycota的数量相对春季较丰富（P<0.03），使用绝对丰度数据时，这些差异无统计学意义。

 

图5 通过（a）相对丰度和（b）绝对浓度分析气溶胶样品中真菌门分布

在种、属和纲水平上也进行了季节比较。经过多次比较调整后，许多种、属和纲的相对丰度在某一特定季节明显更丰富（表2）。

 

表2秋季或春季相对丰度较高的真菌类群

通过测序确定了八种已知的致敏/或致病菌，包括A. alternata, Aspergillus ustus, Aspergillus versicolor, C. cladosporioides, E. nigrum, Penicillium bre-vicompactum, Pleospora herbarum, Stachybotrys chartarum（表3）。比较了这些物种在春季和秋季的相对丰度和绝对丰度，在这八种致敏性/致病性物种中，使用相对丰度，只有C. cladosporioides在秋季明显丰度，在春季则没有一种物种更丰富；使用绝对丰度，没有物种有显著差异。

 

 

表3基于相对丰度或绝对丰度，春季或秋季更丰富的致敏/致病物种和属

潜在的致敏性和/或致病性分类群也在属水平进行了检测，其中一些属无论使用相对丰度或绝对丰度在春季或秋季都更丰富（表3，图6a和b）：使用相对丰度，Aspergillus, Cladosporium, Fusarium春季较为丰富，而Cryptococcus, Penicillium, Ulocladium在秋季较为丰富。使用绝对浓度，秋季只有Alternaria更为丰富，春季则无致敏性和/或致病性属更为丰富。因此，基于相对丰度和绝对浓度的数据解释支持关于季节性真菌差异的不同结论。由于春季两个采样日期（E/F和I/J）中的大气总真菌量较低，而秋季L样本中的大气总真菌量较高，因此在使用基于相对丰度的方法进行定量比较时，在这些日期暴露于所有过敏原就会被误解。

 

图6 致敏性和/或致病性种属的热图。a使用相对丰度数据，b使用绝对丰度数据

 

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