Hepatology--单细胞转录组测序：仅1个组织样本+2种细胞系

发稿时间：2019-02-25来源：天昊生物

 

文章题目

Single-Cell Analysis Reveals Cancer Stem Cell Heterogeneity in Hepatocellular Carcinoma, Hepatology, IF: 14.079, 2018年7月，DOI: 10.1002/hep.29778.

 

研究背景

肝细胞癌（HCC）的异质性对于其治疗是个巨大的阻碍，然而在单细胞水平上揭示HCC瘤内异质性的报道还十分有限。肿瘤干细胞（CSCs）在肿瘤异质性中扮演重要角色，同时助长了治疗抗性、肿瘤复发和转移。因此急需从肿瘤细胞群落、细胞层次结构和特定癌种的细胞多样性等角度去了解瘤内异质性。当前的研究策略多是基于bulk tissue（块状组织），这样的方法不足以很好地揭示肿瘤进化和细胞群落。然而单细胞测序技术是解决这一问题的完美方案！

 

技术路线

 

 

主要内容

 

1. 肝CSCs表型和异质性验证

基于已经明确的HCC CSCs细胞表面marker，首先利用免疫荧光染色和流式分析表征商业化的抗体鉴定不同CSC亚群的能力，包括CD13, CD24, CD44, CD90, CD133, 和EpCAM（图1）。共聚焦成像显示HuH1和HuH7细胞系无论在单分子层（图1A）或球状（图1B）的状态下，CSC亚群的异质性均比较显著。

 

图1 HCC细胞CSC表面marker异质性表达

然后利用流式基于单个marker分选CSC亚群，于96孔板培养评估其自我更新（self-renewal）的潜能。HuH1中大约15%-20% marker阳性的CSC（图2A），HuH7中大约8%-12%可以分化（图2B），而低氧条件下（促进干性）只有特定的CSC亚群能够分化（图2A, B）。然后对培养2周后的单个marker表达的细胞进行计数，发现在HuH1和HuH7细胞中不同CSC亚群其自我更新能力差异巨大（图2C, D）。而与未分选的细胞相比，单个marker表达的细胞可以在不同程度上扩展形成混合的CSCs群（图2E）。

 

图2 marker明确的CSC功能分析

总体上这些结果能够说明利用单个细胞表面marker能够发现明显的CSC亚群，它们具有高度的自我更新的能力。

 

2. 单个肝CSCs转录组图谱及异质性

为了确定单个marker表达的CSC中生物学差异是否与不同的分子特征相关，首先利用单细胞SMART-seq技术对单细胞转录组进行表征，方法策略详见技术路线，分别对单个细胞、10个或100个细胞的pool进行分析，同时结合单细胞转录组测序的公共数据比较，包括人胚胎干细胞（hSEC）、小鼠内皮细胞（mEC）、小鼠造血干细胞（mHSC）。主成分分析发现，每种细胞类型有明显不同的转录组特征（图3A）。无论是HCC细胞系还是新鲜分离的肿瘤样本，每个细胞群下的单个细胞其转录组是不同的，但是这样的不同在10个或100个细胞的pool中会消失，这表明转录组的异质性确实在单细胞水平上存在，而在pool样本中显著降低（图3A）。单个HuH7细胞基于marker表达聚类结果如图3B。

 

图3A-B 单细胞转录组揭示marker明确的CSC异质性

如果单细胞中marker基因表达带来的转录组差异在功能上是重要的，那这些改变应当与HCC生存相关。因此基于3个marker阳性（Triple⁺）和阴性（Triple^-）（CD133/CD24/EpCAM）进行分类比较，其中286个基因与Triple⁺相关。利用这286个基因特征进行预后分析，LCI cohort肿瘤样本中log-rank和permutation分析Triple⁺能够预测整体生存率，交叉验证的结果更显著（图3C）；而在非肿瘤样本中不存在这样的关系（图3D），这说明Triple⁺ marker特征是肿瘤特异性的。相似的结果在TCGA cohort中也有发现（图3E）。

 

图3C-E 基于特征基因进行生存风险预测

对HuH7细胞中基于单个marker分选的CSC亚群分析发现基因表达重叠较少（图4A），网络分析显示与不同maker基因特征相关的top networks大部分也不能重叠（图4C-F）。而这些marker特征能够预测不同cohort的整体生存率（图4B）。

 

图4 marker明确的CSC显著不同的分子信号及预后相关

 

3. 肝细胞群转录组图谱及异质性

为了确定整体细胞群的多样性，利用10x Genomics GemCode技术对HuH1, HuH7和P1中的细胞进行单细胞转录组测序，共3847个单细胞以tSNE可视化（图5），与明确的marker状态下单细胞测序数据一致，出现明显不同的细胞类型（图5A）。已知的CSC marker基因，已知的HCC特异的基因以及干性相关/免疫细胞基因的表达特征如图5B-D，说明细胞间异质性存在。

 

图5 10x Genomics单细胞转录组数据展示

 

结论

文章最后也讨论了研究的局限性：仅仅依据两种HCC细胞系和一个临床样本；数据的优化问题。而文章揭示的HCC中CSC分子组成和异质性可能对于CSC靶向治疗有重要作用，基于单细胞转录组数据评估CSC异质性及预后的价值能对瘤内异质性、肿瘤进展和临床意义提供新的视角。

 

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