2019年2月新文 10X单细胞转录组 仅需4个样本！！！

发稿时间：2019-02-20来源：天昊生物

Cell Reports: The Neonatal and Adult Human Testis Defined at the Single-Cell Level

研究背景

精子形成过程更多地在啮齿类动物中被研究，而对人类精子形成的过程知之甚少，并且两者之间存在显著不同。在人类的相关研究中，精原干细胞（SSCs）是一个焦点，因为其在临床上可能被用于治疗不育；另外一个较活跃的领域则是鉴别标记SSCs的蛋白marker和形态学研究。然而很多这些marker并不能鉴别未分化的精原细胞（SPG），也不能区分分化中的SPG。当前的SPG单细胞RNA测序（scRNA-Seq）文章主要排除了其它睾丸细胞进行的分析，或多或少存在着一定的局限性¹，而这篇文章理论上分析了人类睾丸样本中所有的细胞类型²。

主要内容

1. scRNA-Seq揭示成人睾丸样本中SPG细胞亚群

利用10X Genomics Chromium Single Cell Kit [v2 chemistry]进行文库制备，scRNA-Seq分析了两个能生育个体的睾丸细胞样本（37y和42y），质控后共18723个细胞用于后续分析。其中多种已知的睾丸细胞类型被发现，包括SPG和SPC（精母细胞）等（图1A），而进一步对SPG细胞亚群进行分析发现其由4种不同的细胞群体组成，包括SSC-1, SSC-2,早期分化的SPG及分化的SPG（图1B）。SSC-1和SSC-2中多数细胞有明显的细胞周期基因表达特征，表明它们处于G0或G1期，而较少的细胞处于S期或G2/M期，这也说明多数SSC-1和SSC-2细胞并未增殖或经历缓慢增殖（图1C-D）。为了探索这四种SPG亚群之间发育关系，基于差异表达的基因进行了Monocle拟时轨迹分析，将单个细胞沿发育轨迹进行排列，结果表明这些细胞亚群按如下发育顺序：SSC-1→SSC-2→Early diff-SPG→Diff-SPG（图1E）。

图1成人睾丸样本中SPG细胞亚群

2. 过渡细胞及3种未分化SPG状态的发现

Monocle分析发现在拟时轨迹线性路径中存在一类分支细胞（图1E顶部），这类Monocle定义的细胞又具有三类不同的细胞亚群的特征—SSC-1, SSC-2和早期分化的SPG，聚类分析也能将这些细胞聚在一起，继而推测这些细胞可能是由一类过渡细胞（Transition Cells, TCs）组成，将SSC和分化的SPG阶段连接起来（图2A）。而支持这一假设的依据则为marker基因的表达在早期和晚期细胞中均有出现，而TCs中也共表达了SSC-1和SSC-2中的marker基因（图2A下，2B），在分析过程中也排除了可能由cell doublets带来的影响。

在SSC-1中发现一些基因表达在明显不同的区域（zones），可能是在SSC-1亚群中存在不同的细胞状态（图1B底部），因此仅对SSC-1细胞进行聚类分析。结果显示了三类亚群的存在—SSC-1A, SSC-1B和SSC-1C（图2C-D），三类细胞亚群选择性表达特定的marker基因（图2E）。拟时轨迹分析也发现这三类细胞或单独，或与其它细胞联合，其中SSC-1B细胞富集了最多的SSC（图2F）。

图2 未分化SPG亚群

3. 候选的SSC蛋白marker的鉴别

鉴别人的SSC蛋白marker对于人的SSC研究至关重要，因此利用IHC和IF的方法分别鉴定未分化SPG的marker（图3A-C），结合单细胞测序分析发现PIWIL4和LPPR3能够标记一类高度特异性的未分化SPG亚群，具有SSC的特征。

图3 未分化SPG marker鉴定

4. 新生儿睾丸样本中的细胞亚群

为了评估成人睾丸原始未分化SPG细胞的发育起源，研究人员又利用scRNA-Seq分析了新生儿睾丸样本，质控后来源于两位新生儿（2d和7d）睾丸的14862个细胞被分析。基于已知的marker基因通过聚类分析发现了5种细胞亚群（图4A）。为了进一步阐明新生儿睾丸中生殖细胞（germ cells）的本质，仅对germ cells进行聚类分析，基于一些marker基因又发现了2种新生儿germ cells亚群（图4B），即PGCL和PreSPG（PreSPG-1和PreSPG-2）。

为了进一步揭示这三类新生儿germ cell亚群，将已发表的单细胞转录组数据纳入分析，数据来源于4w-19w胎儿的PGCs ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA ³。Pearson相关性分析发现所有5个妊娠期的PGCs基因的平均表达水平与PGCL亚群相近（图4C）。进一步探寻PGCs和germ cell数据间的发育关系，再进行Monocle轨迹分析，基于marker基因发现这些细胞亚群按如下发育顺序：PGC→PGCL→PreSPGs（图4D）。

5. PGCL蛋白marker的鉴别

数据表明PGCL亚群在胚胎PGCs和成人SPG间是一个重要的过渡阶段，利用IHC方法对PGCLs中差异表达基因进行鉴定以寻找特定的蛋白marker，发现3种蛋白，ETV4, PIM2和POU5F1选择性标记这些细胞（图4E）。

6. 新生儿germ cell发展到近成人SSC的状态

为了确定新生儿germ cell和成人SSC之间的关系，对两者进行合并聚类分析，其中SSC-1细胞形成了大的细胞群，囊括了PreSPG-1和PreSPG-2（图4F）。拟时轨迹较好地验证了PGCL细胞是最未分化的新生儿细胞亚群，其它依次为PreSPG-2, PreSPG-1和SSC-1（图4G）。

图4新生儿睾丸样本中的细胞亚群

7. 体细胞出现在发育的和成人的睾丸中

为了更精确的确定新生儿和成人睾丸中的体细胞，需要仅对新生儿和成人睾丸中的体细胞进行聚类分析（图5A-B），细胞周期基因表达分析发现体细胞几乎没有处于细胞周期的更新中（图5C）。类似于以上分析步骤，对这些体细胞群也进行了marker基因分析和拟时轨迹分析（图5D-F）。

图5 睾丸样本中体细胞亚群分析

结论

男性生殖细胞发育是个复杂的过程，从胚胎生殖细胞到PGCs，再通过一系列状态的改变，包括增殖、凋亡和分化形成SSCs，SSCs通过自我更新和分化，继而生成精子。生殖细胞发育过程模型如图6所示。

图6 男性配子发育过程模型图

参考文献：

1.  Guo, J. et al. Chromatin and Single-Cell RNA-Seq Profiling Reveal Dynamic Signaling and Metabolic Transitions during Human Spermatogonial Stem Cell Development. Cell Stem Cell 21, 533-546 e6 (2017).

2.  Sohni, A. et al. The Neonatal and Adult Human Testis Defined at the Single-Cell Level. Cell Rep 26, 1501-1517 e4 (2019).

3.  Guo, F. et al. The Transcriptome and DNA Methylome Landscapes of Human Primordial Germ Cells. Cell 161, 1437-52 (2015).