Peer J：整合高通量绝对丰度定量方法解析土壤细菌群落及动态

发稿时间：2019-02-15来源：天昊生物

英文题目: Assessing soil bacterial community and dynamics by integrated high-throughput absolute abundance quantification

中文题目：整合高通量绝对丰度定量方法解析土壤细菌群落及动态

期刊名：Peer J

发表时间：2018年

研究摘要:

高通量测序方法，结合物种分类和其相对丰度信息，对微生物生态学研究具有显著的促进作用。然而，相对丰度并不能反映微生物群落的真实数量和类群间的样本差异。在这项研究中，我们改进并应用了一种高通量绝对丰度定量方法（iHAAQ），这种方法将相对丰度（高通量测序）和细菌总数（定量PCR）结合在一起从而对土壤细菌群落进行定量分析。通过内参菌株EDL933和实验室菌株WG5验证了iHAAQ方法。iHAAQ法在土壤菲（PHE）生物降解研究中的应用表明，对某些细菌类群而言，相对丰度和绝对丰度的变化是一致的，而其它细菌类群相对丰度和绝对丰度的变化则相反。随着微生物活性抑制剂（叠氮化钠）的加入，土壤优势细菌类群（包括Bacillus, Flavobacterium, Paenibacillus）的绝对丰度显著降低，但在培养28天后相对丰度增加。结果表明，使用绝对丰度和相对丰度的iHAAQ方法比常规扩增子测序得到的相对丰度更能真实反映土壤细菌群落的动态变化。

研究背景:

细菌是土壤生态系统的重要组成部分，在土壤生态系统的物质循环和能量流动中起着至关重要的作用。据估计，地球上有4-6×10³⁰个原核生物细胞，土壤中就有2.6×10³⁰个，因此土壤具有地球上最丰富多样的细胞生命形式。关于土壤细菌个体及其群落已经研究了多年，但仍有85-99%以上的细菌不能在培养基中分离和生长，因此关于土壤有多少细菌（绝对和相对丰度）和它们是谁（物种种类）仍是一个未知问题，在过去的几十年里，科学家们试图回答这些问题，传统的平板菌落计数法可同时获得土壤细菌绝对丰度和相对丰度信息，但由于可培养菌的百分比较低，因此该方法存在局限性。目前许多其它方法已被用于探索土壤细菌群落的绝对或相对丰度，例如Brookes等人试图通过测量土壤中的微生物生物量碳(MBC)、微生物生物量氮(MBN)来估算总微生物丰度。随着分子生物学的发展和特定靶基因的验证，定量PCR也成为一种测量土壤中微生物绝对丰度有力而准确的技术。各种生物标志物和分子方法对土壤细菌群落结构的研究也有一定的参考价值，这些方法包括磷脂脂肪酸（PLFAS）、聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）、克隆文库、催化报告沉积荧光原位杂交（CALD-FISH）、微流控qPCR等。特别是高通量测序，该方法开创了微生物学的新纪元，经微生物模拟群落和多项研究证实，该方法能以前所未有的信息量揭示土壤细菌群落的相对丰度和种类。由于高通量测序技术可以获得相对丰度信息，因此，已经有数个研究将高通量测序技术与总微生物的绝对定量方法相结合从而可以得到微生物群落变化更多信息。例如，将流式细胞仪（FCM）、三磷酸腺苷（ATP）、异养平板计数（HPC）、qPCR、PLFAs、MBC等方法结合，对总微生物的绝对丰度进行定量分析。例如，Prest等人结合FCM和16S rRNA扩增子测序，成功揭示了饮用水中细菌群落的变化。Dannemiller等人结合qPCR和高通量测序方法对真菌气溶胶种群进行了定量比较。最近，张等人结合ATP、qPCR、PLFAs和高通量测序技术得到的结果，对两个不同位置的土壤细菌群落进行了调查。但是到目前为止，还没有研究将总微生物的绝对量化方法和高通量测序数据相结合来解析土壤细菌群落，这是因为土壤比其它环境更复杂。如前所述，qPCR法是一种精确测定基因绝对丰度的方法，而高通量测序是测定细菌群落相对丰度的主要方法，因此，本研究结合qPCR和高通量测序技术，提出了一种定量土壤细菌生态学的整合高通量绝对丰度定量方法(iHAAQ)。iHAAQ方法的准确性通过内参菌株大肠杆菌O157:H7菌株EDL933进行了验证，这个内参菌株可以很容易地与土壤中的本底细菌进行分类和区分，此外，由于内参菌株含有鞭毛生物合成蛋白flic基因，因此可以用qPCR方法进行绝对定量。

研究方法：

细菌菌株、培养基和化学品：

将菌株EDL933在37℃摇床（250rpm）上培养后， 4℃离心（6000×g，10 min）收集，用无菌去离子水洗涤3次。将细胞颗粒重新悬浮在无菌去离子水中，使细胞浓度接近2.1×10 ¹¹ cfu/ml，用无菌去离子水稀释菌株EDL933梯度浓度至2.1×10¹¹～2.1×10⁶ cfu/ml，并加入土壤样品中。从江苏省多环芳烃PHE污染土壤中分离得到了一株具有较高降解PHE能力的Massilia sp.WG5菌株（微生物降解是去除土壤PHE污染的最主要途径），在LB培养基中预培养后，在4℃（6000×g，10分钟）离心收获菌株WG5，并用无菌去离子水洗涤三次，然后将细胞颗粒重新悬浮至D 600nm 1.0（约1.5×10 ⁸ cfu/ml）备用。

实验设置和DNA提取：

土壤是从中国福建省一家钢厂附近的表层（0-20厘米）收集。使用冰袋冷却器将三个复合土壤样品送至实验室，然后，将土壤过筛（2mm）并储存在4℃以供使用。试验包括10种处理：对照（仅土壤），命名为Cont；添加6种菌株EDL933浓度的土壤（10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴ cfu/g干重土壤），命名为E9、E8、E7、E6、E5和E4；添加PHE的土壤（100 µ g/g干重土壤），命名为P；添加PHE（100 µ g/g干重土壤）和WG5菌株（1.00×10 ⁷ CFU/g干重土壤）的土壤，命名为W；添加PHE（100 µ g/g干重土壤）和叠氮化钠（NaN3，0.1%，w/w）的土壤,，命名为S, 添加叠氮化钠目的是抑制微生物的天然活性。在组别E9、E8、E7、E6、E5、E4时，将梯度浓度分别为2.1×10 ¹¹-2.1×10 ⁶ cfu/ml的1.0ml菌株EDL933添加到每个土壤样品（30 g冻干基）中。使用E9、E8、E7、E6、E5、E4和Cont建立了iHAAQ方法，利用P、W和S揭示PHE生物降解过程中土壤细菌群落的动态变化。

将30 g（冻干基）土壤放入100 ml烧瓶中，每个处理制备三份样品。添加无菌去离子水，将所有处理过的土壤彻底混合两小时，并将土壤湿度调整为100%的田间容量（土壤含水量为-33 kPa）。立即从每个烧瓶中取样10克（冻干基）土壤，此外，所有处理P、W和S的烧瓶在28±1°C的黑暗中培养，每周在干净的工作台上通气30分钟，添加无菌去离子水以补偿培养过程中的土壤水分损失, 并保持样品的恒定土壤水分含量，培养28天后，从处理P、W和S的每个烧瓶中抽取10克（冻干基）土壤进行DNA提取。

从烧瓶中采集的所有土壤样品立即冷冻并储存在−80 °C冰箱中。使用MoBio PowerSoil DNA Isolation kit提取每份采集样品, 提取的DNA在qPCR分析前存储在同一个−80°C冷冻室中。

定量PCR分析：

用Steponeplus Real-Time PCR仪器对提取的DNA特异基因进行qPCR分析：选择341F-534R（V3）、520F-802R（V4）这两对引物分别检测总细菌16s rRNA基因拷贝数。为了检测菌株EDL933绝对丰度，从其染色体中选择了fliC基因进行qPCR检测。标准曲线是用含有16S rRNA和flic基因片段的质粒10倍梯度稀释得到的，从16s rRNA和flic基因的标准曲线计算出所有基因拷贝数。

高通量测序和数据处理：

用V4区引物（520F和802R）扩增Cont、E9-E4、P、W和S处理组的细菌群落，然后用Illumina miseq平台进行测序。使用QIIME软件（版本1.7.0）对原始序列读取进行质量控制, 如果移动5bps窗口中的平均质量低于Q20，长度小于150bps，且条形码不明确，则删除序列。配对的末端序列用相同的指数拼接，重叠不小于10bps，使用FLASH没有错配。经过质量过滤后，具有97%相似性的序列使用UCLUST进行聚类，分类为OTUs。然后，使用RDP分类器对OTUs进行分类，以匹配Silva数据库。

iHAAQ法对土壤细菌及其群落进行绝对定量：

将总细菌数（qPCR得到的总细菌16s rRNA基因拷贝数）和高通量测序得到的相对丰度相乘可以计算出土壤细菌群落中各门或属的绝对丰度（图1）。基于16S rRNA基因V3和V4得到的总细菌数和高通量测序得到的相对丰度计算出内参菌株EDL933的绝对丰度（ESCH-V3和ESCH-V4）。由于不同细菌基因组中16S rRNA基因的拷贝数不同，本研究使用了EDL933菌株，其基因组中16S rRNA基因具有7个拷贝，fliC基因具有1个拷贝。为了验证iHAAQ方法，在提取DNA前，将内参考菌株（IRS）引入土壤中，并用iHAAQ和qPCR方法进行测定，然后对iHAAQ法得到的内参菌株绝对丰度（ESCH-V3和ESCH-V4）和qPCR得到的内参菌株7×flic基因拷贝数对数转换后进行线性回归分析，将这两个结果进行线性回归分析后从而验证了iHAAQ方法的有效性。

图1 iHAAQ方法及其验证程序的示意图。

研究结果：

qPCR法测定菌株EDL933和细菌总数

对于V3和V4区，本底细菌总数（16S rRNA基因拷贝数）分别为3.53×10⁹±1.23×10⁸和5.82×10⁹±3.29×10⁸拷贝（每g干重土）。对于V3和V4区，E9-E4处理的细菌总数分别为7.00×10¹⁰-3.53×10⁹和7.23×10¹⁰-5.82×10⁹拷贝（每g干重土）。E9和E8中V3和V4区域的总细菌量显著高于其它处理中的细菌总量（图S1）。与本底细菌总数（~10⁹拷贝/每g干重土）相比，添加菌株EDL933在处理E4-E7中对细菌总数仅有轻微影响（图S1）。

图S1 不同处理土壤中细菌16S rRNA基因的拷贝数

建立了fliC基因在3.60×10¹～3.60×10⁹拷贝数范围内的标准曲线。在E9～E4处理中，fliC基因的Ct值（13.73±0.05～29.66±0.06）均在标准曲线范围内。fliC基因拷贝和添加的EDL933菌株浓度（数据转换成对数10）与线性模型（R²=0.999）吻合得很好（图S3），无论有无截距，其斜率均接近1，说明提取的土壤DNA中对fliC基因进行定量可以准确预测土壤中EDL993菌株的浓度。

图S3 添加的内参菌株EDL933浓度和qPCR检测到的EDL933菌株flic基因拷贝数的线性回归

iHAAQ方法的建立和验证

经质量筛选，共有465220条高质量序列（每个样本66460个序列），可分为35门。在属水平上，在Silva数据库中鉴定到了内参菌株EDL933，将其分类为志贺氏埃希菌属。E4-E9组志贺氏埃希菌属的相对丰度远高于对照组，并且当更多的菌株EDL933添加到土壤中时，其相对丰度增加（图2）。

图2不同处理下内参菌株EDL933（志贺氏埃希菌属）的相对丰度。

E9处理组大肠杆菌志贺氏菌属在变形杆菌门中的比例为89.76%，而对照组为0.07%，fliC基因拷贝乘以7倍后（标记为7×fliC），除E4外，其它组总菌绝对丰度数量级与ESCH-V3和ESCH-V4相同（表1）。方差分析结果表明，除E4外，7×fliC和ESCH-V4无显著性差异。此外， qPCR检测到的内标菌株EDL933的7×fliC基因拷贝数和iHAAQ方法检测到的ESCH-V3和ESCH-V4绝对拷贝数呈线性相关（表1，图3），表明ESCH-V3和ESCH-V4的绝对丰度可以可靠地预测EDL933菌株的7×fliC基因拷贝（图3），因此基于qPCR和高通量排序的iHAAQ方法可用于计算菌群绝对丰度（图1和图4）。

表1用qPCR（flic基因和7×flic基因）和iHAAQ方法(Esch-V3 和 Esch-V4)检测和计算土壤中添加的内参菌株EDL933拷贝数（每g干重土）。

图3不同处理中qPCR检测到的内标菌株EDL933的7×fliC基因拷贝数和iHAAQ方法检测到的ESCH-V3和ESCH-V4绝对拷贝数的线性回归

图4不同处理中主要门的绝对丰度

iHAAQ检测土壤细菌群落动态

从7天培养到28天，处理P中残留的PHE迅速从22.01降至8.44μg（每g干重土），处理W中残留的PHE从7.53降至4.38μg（每g干重土）。与处理P和W相比，处理S含有最高的残留PHE，并且在28天培养期间变化最小。按照图1所示的程序，采用iHAAQ方法对土壤细菌群落在P、W和组别中的动态进行了评价。P、W处理的细菌总数随培养时间增加而增加，S处理的细菌总数随培养时间增加而减少（图S4）。

图S4 不同土壤样品总细菌16S rRNA基因拷贝数，P、S和W处理分别代表添加了PHE、NaN3和菌株WG5的土壤。

样本主要有17个细菌门，相对丰度的动态反映了培养过程中土壤细菌组成的变化（图S5）。总的来说，半数以上的门相对丰度随培养时间增加而降低。P组的Firmicutes, Proteobacteria, Planctomycetes, Bacteroidetes, Actinobacteria分别下降5.58%、1.93%、1.59%、1.28%和1.24%；W组的Proteobacteria, Firmicutes, Verrucomicrobia分别下降9.24%、3.41%和0.93%；S组的Actinobacteria, Chloroflexi, Gemmatimonadetes, Proteobacteria分别减少了6.57%、4.24%、2.77%和1.40%，而S组的Firmicutes从8.53%大幅增加到25.87%，最终成为土壤中的优势菌。

图S5 门水平不同处理培养过程中土壤细菌相对丰度的变化

然而相对丰度并不能提供土壤中细菌总数变化的信息。根据iHAAQ方法计算的绝对丰度，只有P组中5个门的相对丰度和绝对丰度同时下降，其它门的相对丰度和绝对丰度则都呈现相反的趋势（图1，5–7）。例如，P组Proteobacteria的相对丰度和绝对丰度的差异尤为明显，相对丰度下降6.67%，而V3和V4区的绝对丰度分别增加42.22%和21.02%，在W和S组中也观察到了这种相对丰度和绝对丰度不一致的结果。

图5用iHAAQ法测定的不同土壤样品中主要门的绝对丰度

相对丰度和绝对丰度之间的差异也出现在属水平上（图7）。在P组，用V3和V4区域分别观察到135和57个属相对丰度和绝对丰度相反结果。而在W组，V3和V4区域分别有77和160个属的相对丰度和绝对丰度相反结果。而在S组，V3和V4区域分别有258和245个属的相对丰度和绝对丰度相反结果。在P、W组有一个共同趋势：各属相对丰度呈下降趋势，绝对丰度则呈上升趋势。而S组则是各属相对丰度呈增加趋势，绝对丰度则呈降低趋势。例如，在S组中，优势属Bacillus的相对丰度从3.67%增加到13.11%（图7），但绝对丰度下降20%以上。

用高通量测序法测定了W0样品中添加的实验室WG5菌株，将其归为Massilia属，W0中Massilia属的相对丰度高于P0和S0样品。土壤在28℃孵育28天后， Massilia属在W组土壤中的相对丰度和绝对丰度变化程度也不同：在第0天（W0）和第28天（W28）（图7），Massilia属相对丰度分别为10.71%和2.71%，下降了近四分之三（74.70%）,而W0和W28样品Massilia属在V3和V4区的绝对丰度则分别减少了不到三分之二（63.69%）和一半（51.84%）。

图7处理P、W和S代表属的相对丰度和绝对丰度

热图分析也显示了处理过程中细菌相对丰度和绝对丰度之间的差异（图6）：基于相对丰度，将P0、W0和P28、S0样品分为两组，而W28和S28样品则远离这两组（图6A）。然而，基于绝对丰度的聚类结果却完全不同， P28、W28样本聚类为同一组（图6B），P0、W0和S0、S28样本聚类为两个不同的组（图6B）。

图6热图显示了由iHAAQ方法(16S rRNA基因V4区)量化的主要门相对丰度（a）和绝对丰度（b）。