【昊阅读】人类基因组调控元件到底调控了谁？最新的CELL文章给出研究方案

发稿时间：2019-01-14来源：天昊生物

2019年1月3日，最新的CELL文章结合了最前沿的两个技术-- CRISPR-Cas9基因编辑技术和单细胞测序技术，探究了基因组调控元件与其真正的靶基因关系配对。随着基因组研究技术的不断发展，相信研究者会解开更多的基因组未知信息。今天，小编就和大家一起看看这篇文章是怎么样的一种研究方案。

英文题目：A Genome-wide Framework for Mapping Gene Regulation via Cellular Genetic Screens

中文题目：通过细胞遗传筛选定位基因调控的基因组框架

发表期刊：Cell

影响因子：31.4

敲重点：
• 扰乱了5,920个人类候选增强子对基因表达的影响

• 每个单细胞转录组含有约28个多重 CRISPRi扰动

• 提升eQTL分析框架，确定了664个顺式人类增强子-基因对

• 确定与这些增强子-基因对相关的基因组特征

图： 摘要图片版

研究背景

•  人类基因组中已鉴定了超过一百万个候选调控元件，但几乎所有元件都未经验证且其靶基因也是不确定的。

•  确定每个候选原件是否真正起作用，如何起作用，以及确定每个遗传关联的真正功能性变异，将需要基于大量基因组序列的功能研究。

研究方法

•  作者提出了一个多重的表达数量性状基因座（eQTL）-增强子-基因对的框架，研究方法是通过在每个细胞引入CRISPR / Cas9介导的扰动的随机组合，然后进行单细胞RNA测序（RNA-seq）。

图：多重增强子-基因对筛选方法

l  预实验确定研究方案可靠性—针对K562细胞中的1,119个候选增强子进行多重增强子 - 基因对筛选测试

A：基于增强子相关特征选择1,119个候选增强子，每个设计两个特异性靶向gRNA

B：

（i）将gRNA克隆到慢病毒载体中，并以高感染复数递送至K562细胞。 （ⅱ）对这些细胞进行单细胞RNA-seq，同时捕获每个细胞中存在的多个gRNA。 

（iii）对于每个候选增强子，根据是否包含靶向它的gRNA进行细胞分组。 （iv）对于每个这样的细胞分组，我们测试了两者之间候选增强子1 Mb范围内基因的群体表达差异

l  升级试验--作者使用dCas9-KRAB干扰了5,920个候选增强子（对其靶基因没有强烈的先验假设），通过分析254,974个单细胞转录组数据确定干扰效果。

研究结果

l  预实验结果：（图C）将gRNA以高感染复数递送至K562细胞，每个细胞鉴定中值为15±11.3个gRNA。 （图D）产生总共47,650个单细胞转录谱。每个扰动的中位数为516±177个细胞。 （图E）差异表达测试的分位数 - 分位数图。（图F）靶向转录起始位点(TSS)（顶行）和b-珠蛋白LCR阳性对照（底行）的表达。被gRNA靶向干扰的基因与NTC（未靶向对照）相比，表达差异显著。

l  升级试验结果：（图A）对于升级试验，设计gRNA以靶向总共5,779个候选增强子。（图B）从K562 DHS中选取948个探索性候选增强子。对预试验的978个候选增强子用相同的gRNA对重新靶向，并且其中377个也用第二个替代gRNA进行靶向。（图C）gRNA再次递送至K562细胞，但感染复数高于预实验（每个细胞中位数为28±15.3gRNA）。（图D）共产生207,324个单细胞转录谱。每个扰动在915±280个单细胞中鉴定。

（图E）差异表达测试的Q-Q图。显示了靶基因表达（橙色）的减少。

（图F）每个候选增强子影响的靶基因数目的直方图（10％经验FDR）。

（图G）作为调节每个靶基因而检测到的成对候选增强子数的直方图（10％FDR）。

（图H）筛选出664个（470个高可信度）增强子-基因对的效应值（通过10%FDR）。97%的TSS对照，测序数据确定其基因表达被抑制。

l  单例实验对22个选定的Enhancer-Gene对进行复制和验证（包括16个增强子-基因对，和6个没有靶基因的增强子）。验证结果表明，13个增强子的效力和方向与前期试验一致，而3/16未能验证。

l  解析人类增强子的性质以及增强子和配对靶基因启动子之间的距离:（图A）成对的候选增强子在位置上靠近靶基因。（图B）470个高可信度对中的317个靶向最近端的K562表达基因。（图C）增强子对不同基因群的调控效应。（图E）增强子 - 基因对在K562 Hi-C数据中表现出更频繁地相互作用。

研究结论：该研究框架将促进增强子-基因调控相互作用的大规模图谱绘制，增强子 - 基因调控相互作用是人类基因组顺式调控环境中一个关键但尚未完全已知的组成部分。