Science of the Total Environment：利用高通量绝对丰度定量方法解析土壤细菌群落结构和动态变化

发稿时间：2018-12-28来源：天昊生物

英文题目: Use of an improved high-throughput absolute abundance quantification

method to characterize soil bacterial community and dynamics

中文题目：利用改进的高通量绝对丰度定量方法解析土壤细菌群落结构和动态变化

期刊名：Science of the Total Environment

发表时间：2018年

影响因子：4.65

研究背景:

一个群落，如生态学所定义的，主要由三个基本属性：绝对丰度，相对丰度和物种类型。物种的相对丰度可由绝对丰度来计算，但绝对丰度不可以通过相对丰度计算出来。在定量生态学中，绝对丰度为一个物种提供了准确的信息，而相对丰度则可用来描述一个群落中的不同物种组成。

目前的高通量测序技术，可以在一个群落中检测到数以千计的OTUs，这极大地扩展了我们对其物种类型和相对丰富度的深刻理解。虽然相对丰度可以描述微生物群落中的优势物种，但是当进行多个群落物种比较时，相对丰度就不如绝对丰度更有效。近年来，高通量测序与微生物定量技术相结合，如流式细胞（FCM）、定量PCR（qPCR）、磷脂脂肪酸（PLFAs），用以获得空气、水和土壤中微生物的绝对丰度，这些研究都发现微生物相对丰度和绝对丰度得到的结果趋势不一致。

值得注意的是微生物总数的精确定量是获得可靠微生物绝对丰度的关键。但是用几种方法测量同一样品是耗时的，而不同方法的组合又可能增加结果的不确定性，例如，用FCM方法检测的北京土壤样品中细菌总生物量的平均值高于西藏土壤样品，而用MBC方法测得的北京和西藏土壤样品中细菌总生物量的平均值则相反，显然，基于FCM和MBC计算的土壤细菌绝对丰度是不一致的。因此，提出一个既能减少操作过程或不确定性，又能高通量可靠地获得微生物绝对丰度的简单方法就显得尤为重要。

研究目的:

1） 提出了一种通过添加内标菌株(ISS) HAAQ-GFP来准确解析土壤细菌群落及其动态变化的高通量绝对丰度定量方法（HAAQ）。

2） 确定该方法的最佳实验条件。

3） 研究不同阶段(土壤及其母质)和叠氮化钠处理土壤中的细菌种群分布及其动态变化。

HAAQ方法描述：

1） 采用显微镜计数法对内标菌株(ISS) HAAQ-GFP进行绝对定量。

2） 向土壤中加入一定量的内标菌株(ISS) HAAQ-GFP悬浮液，并在提取土壤DNA之前与土壤颗粒充分搅拌。提取土壤DNA后，对DNA样品进行16S rRNA基因扩增子测序从而得到相对丰度。

3） 利用内标菌株(ISS) HAAQ-GFP的相对丰度和绝对丰度，首先计算土壤原生细菌的总绝对丰度。然后，通过总绝对丰度乘以相应的相对丰度，得到每个分类单元的绝对丰度。通过各分类单元水平的绝对丰度和其他衍生指数揭示了土壤细菌生态的数量。

图1  HAAQ方法的工作流程

土壤样本和实验设计：

实验土壤样品是从菜地表层(A horizon)和福建和浙江的部分风化层(C horizon)采集。利用带冰袋的冷却器将每个取样点的三个土壤样品带到实验室。土壤母质（紫砂岩）分别从C horizon的三份样品中选择，并在过筛前用液氮粉碎。去除植物残渣和石块后，将散装新鲜土壤用2mm塑料网过筛，将其彻底均匀化，然后储存在4°C。为确定ISS HAAQ-GFP在土壤样品中的最佳添加浓度，在福建省采集的10g冻干土中添加0.4mL浓度梯度为3.10×10¹¹-3.10×10⁶细胞/mL的ISS HAAQ-GFP。将ISS HAAQ-GFP的细菌悬液均匀地喷洒在土壤样品表面，然后与无菌玻璃棒充分混合5分钟。特别建立一系列6个ISS HAAQ-GFP细胞浓度的土壤处理样品，分别为10¹⁰-10⁵细胞/g，称为处理T10-T5，同时向土壤中添加相同体积的无菌水作为对照。

统计分析：

利用大肠杆菌属Escherichia的相对丰度和ISS HAAQ-GFP的绝对丰度，使用以下方程计算土壤总原生细菌的绝对丰度：其中Ii是各接种处理中ISS HAAQ-GFP的绝对丰度，Ri和Rc分别是各接种处理和对照中相关大肠杆菌属Escherichia的相对丰度，Z和T分别是原生大肠杆菌属Escherichia和土壤总原生细菌的绝对丰度。

与处理T10-T5相对应，计算公式Eq. (1)土壤原生细菌总数（T）有6个绝对丰度，然后用相对丰度乘以每个处理(T10-T5)土壤原生细菌总数(T)+ISS HAAQ-GFP(Ii)绝对丰度总和来计算每个属的绝对丰度，从Eq. (1)得到的T10-T5在属水平上的绝对丰度数据集称为E10-E5。根据对照组每个属的相对丰度乘以T10-T5土壤原生细菌总数(T)，得到属水平上绝对丰度的额外数据集(E10c-E5c)。

   我们检测了和内标菌ISS HAAQ-GFP归属于同一属的土壤原生相关大肠杆菌属Escherichia是否会影响数据分析，因此在另个一个计算公式Eq. (E1)中将土壤原生相关大肠杆菌属视为零。

研究结果：

内标菌株(ISS) HAAQ-GFP绝对定量

对10幅图像进行细胞计数(图2A），ISS HAAQ-GFP平均浓度约为3.09×10⁷细胞/mL。用平板计数法和显微镜计数法测得的2倍梯度稀释的ISS HAAQ-GFP浓度之间存在相关性（图2B）。T10-T5处理土壤中添加的ISS HAAQ-GFP含量范围为1.23×10¹⁰-1.23×10⁵ 细胞/g干土。

图2 本研究中ISS HAAQ-GFP的测定。A、激光扫描共聚焦显微镜下细菌悬液中ISS HAAQ-GFP的一幅荧光图像。B、在2倍梯度稀释液中通过平板计数（Y轴，CFU /mL）获得的ISS HAAQ-GFP浓度与显微镜计数方法（X轴，细胞/mL）的相关性。

土壤细菌群落的相对丰度

经过质量过滤，获得29953个OTU（852,842 reads），通过RDP和Greengenes数据库进行分类，对照土壤中以Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Firmicutes为主，占土壤原生细菌总数的67.21±2.33％。

ISS HAAQ-GFP在RDP数据库中被归为大肠杆菌/志贺菌属Escherichia/Shigella，在Greengenes数据库中被归为肠杆菌科的一个未命名属。在处理T5-T10中，随着ISS HAAQ-GFP的添加，log 10转化得到的Escherichia相对丰度呈线性增加（图2C）。对于每个处理，基于RDP数据库和Greengenes数据库得到的大肠杆菌相对丰度没有显著差异。而16S rRNA拷贝数经过校正（RDP adj）后（校正原因：细菌基因组中16S rRNA基因的拷贝数从1到15不等，这将偏离细菌的真实组成，据报道，ISS HAAQ-GFP的16S rRNA基因有7个拷贝数，在RDP和Greengenes数据库中未调整16S rRNA基因拷贝数的情况下，高估了ISS HAAQ-GFP的相对丰度，低估了总细菌的绝对丰度），土壤细菌群落的相对丰度完全改变，例如T9中Proteobacteria的相对丰度从72.01±2.47％（RDP）下降到43.36±3.62％（RDP adj）。

图2 本研究中ISS HAAQ-GFP的测定。C、添加的ISS HAAQ-GFP与处理T10-T5中基于RDP、RDPadj和Greengenes数据库得到的大肠杆菌属相对丰度的关系。

土壤细菌群落的绝对丰度

除T10处理外，T9～T5处理间土壤原生细菌绝对丰度无显著差异（表1）。此外，将基于Eq.1 和 Eq.(E1)（详见统计分析）的计算结果进行比较，大多数属的绝对丰度没有显著差异，只有内标菌Escherichia在E10-E5和E10₀-E5₀两个数据集之间有显著差异，说明对未受大肠杆菌污染的土壤样品，不需要对照处理，并且本研究中细菌群落的绝对丰度仅基于Eq.1。

不同分类水平上的绝对丰度如图3所示，RDP 和Greengenes数据库所测得的门水平，Proteobacteria绝对丰度最高（约为1.00×10⁸细胞/g干土），其次为Acidobacteria, Actinobacteria, Firmicutes。而RDP adj数据库显示细菌的绝对丰度均超过1.0×10⁸细胞/g干土。在属水平上，大多数属的绝对丰度在10^3.5-10^6.5细胞/g干土范围内（图3），在供试土壤中还观察到一些绝对丰度超过10⁷细胞/g干土的属，但绝对丰度在10³细胞/g干土以下的属较少。

表1 使用HAAQ法基于RDP数据库（HAAQ-RDP），RDP数据库通过16S rRNA基因拷贝数校正后（HAAQ-RDP adj）和Greengenes数据库（HAAQ-Greengenes）测定的原生细菌总绝对丰度（细胞/g干土）

土壤细菌群落的频率分布

利用E10-E5和E10c-E5c两个数据集，进一步分析了在属水平上细菌绝对丰度的频率分布（log 10转换）（图3）。除了T10和T9外，大多数属浓度为10^3.5-10 ^6.5细胞/g干土。

随着ISS HAAQ-GFP在T10-T5中的浓度降低，E10-E5与E10c-E5c数据集的重叠程度增加，同时频率分布符合部分对数正态分布（图3）。 处理T10-T5，拟合曲线的形状逐渐变宽（图3）。利用拟合的部分对数正态分布方程，可以预测E10-E5数据集频率分布中的缺失部分，即E10-E5数据集中低丰度未检出属的预测频率（图3中的黑色柱子）。

图3 属水平上细菌绝对丰度的频率计数（对数10（细胞/g干土）。E10-E5和E10c-E5c两个数据集分别代表了处理组T10-T5和对照组基于Eq. (1)计算的每个属的绝对丰度。这些曲线是从E10-E5（红色）和E10c-E5c（灰色）两个数据集的部分对数正态分布拟合得到的。黑色柱子是E10-E5数据集中低丰度未检出属的预测频率。

ISS HAAQ-GFP对土壤细菌群落结构的影响

主成分分析（PCA）表明，随着ISS HAAQ-GFP添加量的增加，细菌群落结构更加变化（图4）。PCA分析表明，E10和E9数据与Ec数据组相距较远，说明与对照相比，T10和T9处理的细菌数量发生了很大的变化。然而T8和T5处理的细菌群落结构与对照靠的很近（图4）。

此外，物种丰富度指数随着添加ISS HAAQ-GFP而发生改变。分别用RDP、RDP.或Greengenes数据库分析时，对照的物种丰富度指标（Genus number,Simpson，Shannon）各不相同。T10各物种丰富度指数均显著低于对照，但处理T9-T5与对照间差异不显著。

图4 在属水平上对由绝对丰度组成的细菌群落结构的主成分分析

HAAQ方法的应用

根据图3,4的结果，当ISS HAAQ-GFP加入浓度在10⁵-10⁷细胞/g干土范围内时，土壤细菌数量生态学的变化可以忽略不计。然后使ISS HAAQ-GFP加入浓度为10⁶细胞/g干土时，进行了两次应用。应用I的结果表明， 在土壤发育过程中，土壤原生细菌的总绝对丰度由3.55 × 10 ⁸ ± 5.93 × 10 ⁷细胞/g（土壤母质）增加到1.70 × 10 ⁹ ± 2.13 × 10 ⁸细胞/g（土壤）（图5A）。总绝对丰度增加后，部分对数正态分布拟合曲线逐渐变宽（图5B）。25个门中，20个门的绝对丰度显著增加，而只有12个门的相对丰度显著增加（图5A），例如，Acidobacteria和Chloroflexi的相对丰度没有显著变化，但是它们的绝对丰度显著增加（图5A）。此外，Actinobacteria和Latescibacteria相对丰度显著降低，但绝对丰度显著增加（图5A）。此外，在属水平上相对丰度和绝对丰度也有不同的变化趋势（图5C和D）。33.87%菌属的绝对丰度和相对丰度呈现相反趋势（图5C中的part I）。在土壤发育过程中，49个属的相对丰度显著降低，而71个属（49属中的25属和额外的46属）的绝对丰度显著增加（图5C）。在土壤发育过程中，相对丰度和绝对丰度均降低的属约占总属7.80％（图5C中的parts II）；相对丰度和绝对丰度均增加的属约占总属的58.33％（图5C中的parts III）。这三种趋势的代表属如图5D所示。

图5 用HAAQ法对土壤及其母质进行细菌生态定量分析。A、门水平细菌的相对丰度和绝对丰度。B、属水平细菌绝对丰度的频率计数。C、属水平上相对丰度和绝对丰度比较的饼图和维恩图。在饼图中，part I，相对丰度下降，但绝对丰度增加；part II or III，相对丰度和绝对丰度都减少或增加。在Venn图中，红色圆圈中的数字表示这些属的相对丰度显著变化，紫、蓝、黄三色的数量代表这些属的绝对丰度显著变化，灰色圆圈数表示属间相对丰度和绝对丰度均无显著差异。红色和黑色箭头分别表示相对丰度和绝对丰度的增加和减少。D、饼图中三个部分（I、II和III）的代表属。PM表示土壤母质。

对于应用II，在叠氮化钠处理土壤中,土壤原生细菌的总绝对丰度由3.85 × 10 ⁸ ± 5.26 × 10 ⁷细胞/g (S0，叠氮化钠处理后培养0天)减少到9.56 × 10⁷ ± 5.36 × 10 ⁷细胞/g (S14，叠氮化钠处理后培养14天) （图6A）。细菌总绝对丰度降低后，部分对数正态分布拟合曲线变窄（图6B）。在17个门中，9个门的相对丰度显著降低（图6A），然而，有15个门的绝对丰度显著降低（图6A）。例如，Acidobacteria 和Candidatus Saccharibacteria的相对丰度没有显著变化，但绝对丰度显著降低（图6A）。此外，在属水平上相对丰度和绝对丰度呈现不同趋势（图6C和D）。大约有40.58%的属在培养14天后绝对丰度和相对丰度呈现相反趋势（图6C中的part I）。在叠氮化钠的抑菌作用下，14个属的绝对丰度显著降低，14个属中有8个属的相对丰度显著增加（图6C）。此外，图6C中的8个属的相对和绝对丰度均有所增加，但其绝对丰度增加不显著。

图6 采用HAAQ法对叠氮化钠处理土壤的细菌生态进行了定量研究。A、在门水平上细菌的相对和绝对丰度。B、属水平上细菌绝对丰度的频率计数。C、属水平上相对丰度和绝对丰度比较的饼图和维恩图。在饼图中，part I，相对丰度增加，但绝对丰度减少；part II or III，相对丰度和绝对丰度分别减少或增加。在Venn图中，红色圆圈中的数字表示这些属的相对丰度显著变化，紫、蓝、黄三色的数量代表这些属的绝对丰度显著变化，灰色圆圈数表示属间相对丰度和绝对丰度均无显著差异。D、饼图中三个部分（I、II和III）的代表属。土壤样品分别在叠氮化钠处理后培养0天(S0)和14天(S14)。

如网络所示，应用I（图7A）和应用II（图7B）中的两个样本分别共有322个属（84.51%）和304个属（98.38%）。图7C和图D分别显示了应用I和II的top20共有属，应用Ⅰ的大多数属（58.33%）的绝对丰度增加，而应用Ⅱ的大多数属（56.82%）则减少。

图7 在两个应用中，属水平上的细菌网络（A，B）和前20个共享属（C，D）。在应用I中，S和P分别代表土壤及其母质。在应用程序II中，S0和S14与图6中的相同。

此外，每个应用测试样本的聚类模式分别以相对丰度或绝对丰度显示（图8），与相对丰度产生的热图相比，绝对丰度更清楚地揭示了各个菌门在样品间的差异。

图8 细菌群落在两种应用中的热图分别由门水平的相对丰度（A）和绝对丰度（B）产生

研究概要：

高通量测序极大地扩展了我们对基于物种类型及其相对丰度信息的细菌群落的理解。近来，研究人员也意识到这种技术不考虑绝对丰度的缺陷。两种或更多种不同的方法结合通常用于实现微生物群落的绝对定量。然而，将不同的方法组合起来不仅费时，而且由于实验条件的变化，还涉及潜在的不确定性。为了简化实验步骤，提高土壤细菌群落的高通量绝对丰度定量（HAAQ），我们提出了利用内标菌株（ISS）HAAQ-GFP同时获得土壤细菌群落相对丰度和绝对丰度的HAAQ方法。结果表明，当ISS HAAQ-GFP浓度为10⁵～10⁷细胞/g时最佳，同时将16S rRNA基因拷贝数调整时，HAAQ法能更好地解析土壤细菌群落及其动态变化。基于HAAQ方法，首次发现供试土壤中细菌在属水平上的绝对丰度符合部分对数正态分布函数，且大多数属浓度在10^3.5-10^6.5细胞/g之间。我们的案例研究还表明，土壤细菌群落及其动态的更全面的描述可以通过相对丰度和绝对丰度来完成，而不是仅仅通过相对丰度。改进的HAAQ方法可以应用于其它微生态学研究同时促进了细菌生态定量研究的发展。