The ISME Journal：为什么微生物相对定量不能代替绝对定量

发稿时间：2018-12-04来源：天昊生物

英文题目: Absolute quantification of microbial taxon abundances

中文题目：微生物类群丰度的绝对定量

期刊名：The ISME Journal

影响因子： 9.520

发表时间：2017年

研究背景 :

基于标记基因(如16S rRNA基因)的高通量扩增子测序技术已经成为一种公认的微生物群落分析方法，这导致了该技术在纵向研究中的广泛应用。然而该测序技术的固有局限性只是计算微生物类群丰度的相对值。因此，我们必须谨慎对待这些相对丰度作出的相应生物学解释，这是因为这种测序技术忽略了样本间总微生物绝对丰度的差异。据我们所知，目前还没有相关研究来评估微生物相对丰度对真实微生物群落结构造成的歪曲影响程度。在本研究中，我们结合使用流式细胞技术测量的细胞密度和16S扩增子测序得到的微生物相对丰度对冷却水系统的中央蓄水池进行了两次广泛的纵向调查，我们量化了微生物类群的绝对丰度，并评估了其是否可以获得额外的不同见解。

研究对象：

对在核试验反应堆上运行的二级冷却水回路系统进行两次40天调查（79个时间点），包括冷却水系统没有运行的时间段（control），冷却水系统启动阶段（start-up），冷却水系统稳态运行阶段（operation）。

研究结果：

根据样品的总细胞密度，计算每个时间点的每个微生物类群绝对丰度，每个微生物类群的细胞密度范围是0.5-1679个细胞/μl。通过执行相对丰度和绝对丰度之间的普通最小二乘回归分析，几个微生物类群间的差异变得明显，我们关注其中三个最丰富的微生物类群，它们完全代表了群落中两个截然不同的淡水分支（图1）。我们发现OTU1(betI-A分支)和OTU2以及OTU3(bacI-A分支分类群)之间存在显著差异，而OTU2和OTU3之间没有显著差异。这些结果表明不同微生物类群的相同相对丰度可能需要依赖于类群的生物学解释，因为它们不一定具有相同的绝对丰度。

图1对在核试验反应堆上运行的二级冷却水回路进行两次时间分离的40天调查（79个时间点）中3个最丰富OTUs的绝对丰度和相对丰度的散点图

为了进一步验证相对丰度的局限性，我们仔细检查了两个微生物分支的时间轨迹（图2）。在解释相对丰度和绝对丰度的时间轨迹时，可能检测到两个主要差异，如果结论仅基于相对丰度，则可能导致误解：1）：在群落成长期间，比如survey 1的start-up和早期 operation阶段，绝对丰度有一个明确的过渡，显示出bacI-A分支的系统生长和衰变。相反，相对丰度分布则很模糊，在生长和衰变过程中，它们始终保持相对恒定，并且开始和结束非常明确，没有任何过渡。2）：在survey2的operation后半部分可以观察到相对丰度和绝对丰度的另一个显著差异，相对丰度曲线显示从±40%增加到90%以上，潜在地暗示了betI-A分支的选择性生长，相反，如果看绝对丰度，那么这个分支就没有明显的活跃生长，其细胞密度从未显著超过start-up阶段结束时观察到的最大密度。这种差异的原因可能是样本中其它微生物类群的衰退从而导致其在群落结构中相对丰度比例增长，但是同时环境却限制了它绝对丰度的真实增长。总的来说，用绝对丰度曲线可以更精确地描述betI-A和bacI-A分支的动态变化。另外相对丰度比例和绝对丰度的相关性较差：只有一个OTU的相对丰度(OTU2)与总细胞密度显著相关,而整个群落组成的平均相关强度仅为-0.08±0.15(n=427)。

图2对在核试验反应堆上运行的二级冷却水回路进行两次时间分离的40天调查期间，2个最丰富的微生物淡水分支(bacI-A(OTU2，红色；OTU3，橙色)和betI-A(OTU1，蓝色))的时间动态图。top panel显示从扩增子测序数据中推断的相对丰度（in%），bottom panel显示绝对OTU丰度（单位为细胞/μl）, 圆形标签表示微生物群落的总细胞密度（单位为细胞/μl±s.d）。最下方灰色区域表示冷却水系统没有运行的时间段（控制阶段），绿色区域表示启动，蓝色区域表示稳态运行。

研究结论：

1. 本文结合扩增子测序方法（16S rRNA基因）和单细胞计数技术（流式细胞术）来定量微生物分类单元的绝对丰度。使用绝对丰度的纵向分析导致产生与相对丰度显著不同的丰度剖面，这些剖面很清楚，可直接用于比较研究。

2. 本文还提供了证据，证明微生物某一类群的富集（相对丰度比例的增加）不一定真正与相应微生物类群的生长（绝对丰度的增加）有关，可能是其它微生物类群的衰退是导致其在群落结构中相对丰度比例的增长。

3. 这些结果能够表明，微生物类群的绝对定量是必不可少的，并且对微生态学内许多悬而未决的问题具有进一步阐明的潜力。同时本文研究结果强调，对于微生物学调查的全面生物学解释，应该同时考虑绝对丰富度，而不能仅仅考虑微生物的相对丰度。