mbio：人类肠道菌群组成和功能差异与伤寒沙门氏菌感染临床结局相关

发稿时间：2018-09-04来源：天昊生物

 英文题目: Compositional and Functional Differences in the Human Gut Microbiome Correlate with Clinical Outcome following Infection with Wild-Type Salmonella enterica Serovar Typhi

中文题目：人类肠道微生物组成和功能差异与伤寒沙门氏菌感染临床结局的关系

期刊名：mbio 

影响因子： 6.689

发表时间：2018年6月

研究背景: 

伤寒沙门氏菌(S.Typhi) 是一种人体限制性肠道病原体，每年导致11.9至2690万人患伤寒。Ty21a是减毒口服疫苗，是预防伤寒的两种广泛使用的疫苗之一。在先前的研究中，我们研究了接受Ty21a疫苗的志愿者肠道微生物群与伤寒杆菌特异性免疫应答之间的关系。人类攻击模型的发展为我们提供了独特的机会，以解析免疫接种和随后暴露于伤寒沙门氏菌后肠道微生物群的组成和功能，并进一步研究粘膜免疫应答与肠道微生物群是否有关。越来越多的证据表明，微生物群的组成可能与免疫原性和口服疫苗效力有关。例如，生活在资源有限环境中的儿童小肠中细菌的过度生长可能导致口服霍乱弧菌减毒活疫苗CVD 103-HgR抗体效价低。此外，其它疫苗，包括轮状病毒和口服脊髓灰质炎疫苗，在资源有限的地区其疫苗效力和免疫原性也降低。通过这些研究，可最终用于提高口服疫苗对伤寒和其它肠道感染的保护作用。

研究对象：

为了研究两种伤寒沙门氏菌口服减毒活疫苗（Ty21a疫苗或疫苗M01ZH09）免疫效果和随后暴露于野生型伤寒沙门氏菌对肠道微生物群组成与功能的影响。我们在英国牛津大学进行的一项研究中，对30名健康成人试验受试者的粪便样品进行了纵向16S rRNA基因和宏转录分析，这些受试者被随机分成三组。这些志愿者是健康男性或未怀孕女性，年龄在18-60岁之间，没有伤寒疫苗接种史或伤寒沙门氏菌感染史。

志愿者接受Ty21a(一种减毒伤寒活疫苗)、M01ZH09(一种减毒活伤寒疫苗候选株)或安慰剂，28天后用野生型伤寒沙门氏菌进行攻击暴露，然后监测临床症状与血液生化反应。在筛选面试（基线1）、首次免疫接种前（基线2）、接种安慰剂和M01ZH09后两个时间点（28天和26天）、接种Ty21a后两个时间点（32天, 30天, 28天, 26天）、伤寒沙门氏菌攻击之前(第0天)、攻击后5个时间点（12小时、1天、3天、7天和10天）收集粪便样本。

技术平台：细菌16S测序区段（V3-V4）；RNA-seq 

研究结果：

微生物群落组成分析

• 16S rRNA基因数据分组为三个聚类：(i)高丰度的粪杆菌 (图1A，绿色垂直条)，(ii) 高丰度的粪杆菌和拟杆菌(图1A，红色垂直条)， (iii) 高丰度的厚壁菌（图1A，蓝色垂直条）。
• 以粪杆菌为主的簇（绿色）的微生物多样性显著低于其他两个（图1B）。而发展成伤寒组（TD）和没有发展成伤寒组（NTD）的受试者之间没有观察到显著差异（图1C）。
• 安慰剂受试者主要以粪杆菌属和厚壁菌属为优势菌，Ty21a受试者主要以粪杆菌属和拟杆菌属为优势菌，M01ZH09受试者主要以厚壁菌属为优势菌（图1C）。
• 利用Spearman’s相关性，发现拟杆菌属和普雷沃菌属是负相关，甲烷杆菌属与Akkermansia, Parabacteroides, Ruminococcus, Coprococcus, Oscillospira是正相关，与Faecalibacterium和Roseburia负相关（图1D）。

 

图1纵向样品微生物组成分析

 宏转录组进行微生物群落分类学分析

• 每个粪便样本的宏转录组测序产生50.4 百万条reads。宏转录组分析鉴定到两个聚类：(i)高丰度的甲烷杆菌转录物 (图2A)；(ii) 多种厚壁菌属。这个结果得到PCA分析的支持，PCA分析证实了两个主要聚类以甲烷杆菌转录本的丰度为区别特征（图2E）。
•  以甲烷杆菌为主簇的微生物多样性与多种厚壁菌属有显著差异（图2B）。而发展成伤寒组（TD）和没有发展成伤寒组（NTD）的受试者之间没有观察到显著差异（图2C）。
• 利用Spearman’s相关性，发现甲烷杆菌属和多样性菌属呈强烈负相关，包括Eubacterium, Faecalibacterium , Ruminococcus, Blautia, Roseburia,Bacteroides（图2D）。拟杆菌属和普雷沃菌属是负相关，这与16S rRNA测序结果类似。
• 我们评估了16S rRNA基因数据与宏转录组数据之间的总体相关性，然而没有观察到显著的关系。

 

图2纵向样品宏转录组分析

• 对宏转录组数据的时间纵向分析表明，无论是接种疫苗期间或暴露于伤寒沙门氏菌后，个体的微生物组成都相对稳定(图3A和B)。在时间纵向分析中甲烷杆菌为主的群落似乎比多种厚壁菌属为主的群落更稳定（图3C）。

 

图3纵向样品的微生物组成稳定性分析

不同类型转录组群落之间的功能差异

• 2种类型转录组群落之间的功能差异随着时间表现出持续的显著差异（图4）:产甲烷菌群落中的基因主要参与甲烷生成、细胞对辐射的响应、二价无机阳离子稳态、原卟啉原IX生物合成、单碳代谢和翻译后蛋白修饰（图4D）。多种厚壁菌属的基因主要参与参与鞭毛组装、鞭毛依赖性细胞运动、细胞孢子形成、单糖运输、甘露糖代谢和纤维素分解代谢。

图4不同类型转录组群落之间的功能差异

与疫苗接种相关的差异表达基因

• 在安慰剂治前后，肠道微生物组的整体基因表达谱没有变化。
• 接受伤寒沙门氏菌口服减毒活疫苗Ty21a的志愿者在免疫前后差异表达的基因相对较少(免疫后4个基因下调，4个基因上调)。这些发现与之前的报告一致，Ty21a的免疫对肠道微生物群的影响很小。
• 相反，在接受M01ZH09疫苗前后，72个基因发生差异表达，29种产甲烷相关基因在治疗中上调，虽然这种差异可能与疫苗接种有关，但这些差异表达基因更可能反映这些样本的微生物组成随时间发生变化。  

菌群类型与临床结局的关系

• 我们观察到野生型伤寒沙门氏菌攻击后的临床结果（TD与没有TD）存在差异，而这种差异与转录组群落类型相关。60%的含有较高丰度甲烷杆菌转录物的志愿者在暴露于伤寒沙门氏菌后没有出现TD症状。相比之下，65%的含有较低丰度甲烷杆菌转录物的志愿者在暴露于伤寒沙门氏菌后表现出与TD一致的临床症状。为了评估临床结局是否均匀地分布于这2个转录组群落类型中（甲烷杆菌属和多样性菌属），进行了卡方检验，结果表明肠道菌群类型与患TD的风险有关。
• 将混合效应回归模型应用于纵向数据，以评估发展或没有发展为TD的受试者在不同时间点(基线、疫苗后和暴露于伤寒沙门氏菌后)每个菌群的平均相对丰度，并比较两组在每个时间点的差异是否显著（表1）。这一分析揭示了高丰度的甲烷杆菌与暴露后不患伤寒疾病显著相关。相比之下，发展成TD的受试者在基基线、疫苗后和暴露后Eubacterium真细菌属的相对丰度显著较高，表明Eubacterium和TD之间存在关系。

 

表1不同时间点菌属平均相对丰度

与临床结果相关的菌群特异性基因表达

• 使用KEGG直系图，我们评估了TD和非TD患者在两个基线样本、伤寒沙门氏菌攻击后1天（D1）或1周（D7）采集样本中的差异表达基因（图5）。
• 观察到一些与氧化应激相关的酶在非TD患者所有时间点都以较高水平表达。在非TD患者中，Barnesiella菌中超氧化物歧化酶（K04564）、Bacteroides菌中过氧化氢酶（K03781）和含锰过氧化氢酶（K07217）在基线水平有较高水平的表达。后者与类杆菌的谷胱甘肽过氧化物酶（K00432）一起在暴露后1天的非TD患者中也以较高水平表达。
• 编码铁硫结合酶（K00196和K14127）的基因在暴露后1天的非TD患者中以较高水平表达（图5）。其他含铁硫酶的基因，包括丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶（K00 169-K00172)和2-氧戊二酸酯(K00187和K00189)作为底物，在暴露后1天的非TD患者中也以较高水平表达。
• 在Bacteroides (K06079)和Blautia (K06201)中，编码铜稳态蛋白的基因在非TD患者基线期中表达水平较高。Streptococcus的铁/锌/铜转运系统ATD结合蛋白(K11706) 在非TD患者基线期中表达水平较高。铜伴侣（K07213）在暴露后1天的非TD患者中也以较高水平表达。
• 热休克蛋白HspR基因属于MerR转录调控因子（K13640），在暴露后1天的非TD患者中也以较高水平表达。
• 比较来自非TD志愿者和TD患者的宏转录组数据，发现非TD患者中几个应激反应基因的表达水平更高，包括来自多个属的伴侣蛋白GroEL（K04077）和GroES（K04078）。此外，编码多重应激抵抗蛋白BhsA(K12151)和热休克蛋白(K03283和13640)的基因在暴露后1天的非TD患者中也以较高水平表达。

 

图5 在基线（BL）、暴露1天后（Post-chall 1D）或暴露7天后（Post-chall 7D），非TD和TD受试者在基因表达上的显著差异◆

研究结论：

1. 在本研究中，我们利用人类攻击模型中解析了人类攻击模型接种疫苗和随后暴露于野生型伤寒沙门氏菌不同时间的肠道微生物群组成(16S rRNA测序)和功能(RNA测序)，用来验证临床结果可能与肠道微生物群有关的假说。

2. 从研究对象收集的纵向粪便样本的宏转录组分析表明，人肠道微生物群有两种稳定的基因表达模式，主要是高丰度的甲烷杆菌转录物和多种厚壁菌属转录物。

3. 接受伤寒沙门氏菌口服减毒活疫苗Ty21a在免疫前后对肠道微生物组成或功能影响最小。

4. 在野生型伤寒沙门氏菌攻击后，甲烷杆菌占优势的转录组菌群在基线期显示出较低的伤寒症状发生风险。

5. 编码抗氧化蛋白、金属稳态和运输蛋白以及热休克蛋白的基因在基线期或伤寒沙门氏菌攻击后无伤寒症状的受试者中存在较高表达水平。

6. 这些数据表明，肠道微生物群中的与氧化还原电位和离子稳态有关的功能差异可能影响野生型伤寒沙门氏菌暴露后的临床最终结果。