Am J Respir Crit Care Med：微生物16S扩增子测序+宿主转录组测序的联合应用

发稿时间：2018-08-27来源：天昊生物

英文题目: Airway microbiota is associated with up-regulation of the PI3K pathway in lung cancer

中文题目：呼吸道微生物与肺癌PI3K通路上调相关

期刊名：American journal of respiratory and critical care medicine 

影响因子： 12.996 

发表时间：2018年6月

研究背景: 

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，超过乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌的总死亡人数。虽然吸烟是肺癌的一个公认的危险因素，但只有15%的吸烟者会患肺癌。同样，COPD /肺气肿是不依赖于吸烟导致肺癌的危险因素，但是只有15%的吸烟者会患有COPD /肺气肿。COPD和肺癌的发展以慢性炎症和致病通路重叠为特征。越来越多的证据表明肺部微生物可能在癌症的发病机制中起作用。肺癌与诸如COPD、HIV和衣原体感染等疾病相关，其中慢性气道感染是常见的。例如在无菌实验大鼠，肺癌的发展相对于对照是相对较低的。给小鼠长期给药脂多糖（LPS）会导致肺肿瘤的发生。在小鼠模型中用抗生素破坏共生细菌生长会影响γδT17细胞应答，导致侵袭性肺肿瘤的发展。使用细菌16S rRNA测序，导致人们越来越意识到下呼吸道微生物环境（统称为肺微生物群）可能在肺部疾病发病机制中起重要作用。在一项小型队列研究中，发现韦荣球菌属和巨球型菌属在肺腺癌患者的下呼吸道中富集。发现在下气道中发现的不同肺微生物群对宿主的免疫表型有影响。我们还报道，下呼吸道富集的口腔厌氧菌群（包括韦荣氏菌）与炎症细胞（Th17细胞）的浸润增加和支气管上皮细胞ERK/PI3K通路的上调有关。重要的是，PI3K通路上调先前被证明是非小细胞肺癌的早期发病事件，调节细胞增殖、存活、分化和细胞侵袭。目前的证据表明，一种低生物量的下呼吸道微生物群可能通过不同的机制影响肺癌的发生，包括诱导宿主炎症通路，产生细菌毒素，改变宿主基因组稳定性，以及释放促进肿瘤的微生物代谢物。在这项研究中，我们假设下呼吸道微生物群的破坏与影响PI3K信号（与肺癌发病相关）通路的呼吸道转录组改变相关。

研究对象：

参加者包括胸部影像学表明有可疑结节的患者和接受临床支气管镜检查的患者。病理组织学诊断将参与者分为肺癌组（n＝39，诊断为肺癌）、疾病对照组（n＝36，良性肺结节）和健康对照组（n＝10）（从未吸烟者，经支气管镜检查表明无呼吸道症状、胸部X射线异常或肺部疾病）。年龄平均为61.2岁，其中男性66%，白人52.9%，吸烟者88.9%，平均烟龄30.9年（表1）。肺癌组（烟龄41.8年），疾病对照组（烟龄29.3年），健康对照组由不吸烟者组成。

 

表1：队列的人口学和临床特征

背景标本是在手术前通过支气管镜的抽吸通道输送无菌盐水获得的。在可疑结节的情况下，通过细胞刷收集下气道样本：(i) “涉及”疾病气道；(ii)在可疑结节对侧叶上的“未涉及”疾病气道。在健康对照组，通过支气管镜检查获得“未涉及”疾病的下气道刷样本。RNAseq样本是通过气道刷获得的支气管上皮细胞。

 

补充图E1：采样方法示意图。

体外上皮细胞暴露

A549细胞系和细菌菌株Prevotella melaninogenica (ATCC#25845)、Streptococcus mitis(ATCC#49456)和Veillonella parvula(ATCC #10790)被用来评估相互作用。每个呼吸道上皮细胞（1x10 6， 2毫升培养基中）暴露于以下每种条件下总共4小时：支气管肺泡液（BAL，100µl），10ng/ml LPS，50µl细菌上清液，10µl热灭活细菌，或单独的稀释缓冲液（对照）。香烟烟雾冷凝液（40μg/ml）加入或不加入细菌产物。

技术平台：细菌16S测序区段（V4）；RNA-seq 

研究结果：

下呼吸道转录组的评价

• PCoA分析显示所涉及的癌症组、疾病对照组和健康对照组之间有显著差异（图1A）。KEGG第3级通路评价了癌症组、疾病对照组和健康对照组功能通路的差异：与对照组相比，“涉及”肺癌样本具有显著上调的信号通路，包括Hippo、MAPK、TNF、Toll样受体、T细胞受体、B细胞受体、上皮细胞细菌侵袭、结直肠癌和幽门螺杆菌途径的上皮细胞信号传导通路（图1B）。然后，我们评估了癌症组、疾病对照组和健康对照组之间转录基因数据的功能富集，重点是差异表达基因。与疾病对照组和健康对照组相比，癌症组有较强的PI3K/AKT和ERK/MAPK信号通路诱导（图1C）。使用基因集富集分析（GSEA），我们比较了（肺癌组与疾病对照组）转录组与先前公布的数据集，结果表明基因表达有显著的重叠，先前观察到的肺癌患者下呼吸道p53、PI3K、EGF受体、Ras等信号通路被诱导得到重现（图1D）。

 

图1 癌症组、疾病对照组和健康对照组之间的气道转录组差异

16S rRNA基因序列数据

• 共190个气道样本（颊和下呼吸道）用于分析16S rRNA基因序列。在120个下呼吸道样本中，62个来自“涉及”疾病的样本，而58个来自“未涉及”疾病的样本。所有190个气道样本和72个背景样本（附图E6A）的分层聚类显示，一些气道样本富含口腔厌氧菌，例如Prevotella、Streptococcus和韦荣氏菌，而其他气道标本则富含背景样品中常见的类群。并且这种分层聚类与下气道或颊部样本的癌症状态无关（附图E6B）。

 

补充图E6：下呼吸道微生物组成的主要差异

• PCoA分析显示样本位置类型不同，样品的β-多样性有显著差异（附图E7A）。

补充图E7：不同类型样品之间微生物组分的差异。

 

• 癌和非癌状态的口腔颊样本的α和β多样性无明显差异（补充图E8A）。

 

补充图E8：不同样本类型的癌和非癌状态α和β多样性比较

 

• 然而，在下呼吸道样本中，癌症组和非癌症组（疾病对照组和健康对照组）在β-多样性上有显著差异（图2A）。LEfSe确定了癌症组与两个对照组之间的分类差异（图2B）。与疾病对照组和健康对照组相比，“涉及”癌症气道样品富集Streptococcus,Veillonella。疾病对照组富集Streptophyta, Moraxellaceae, Stenotrophomonas，而健康对照样品富集Acholeplasma, Acidocella。

图2：癌症组、疾病对照组和健康对照组之间气道微生物的差异

 

多组学分析

• 为了更好解析这个队列中的宿主/微生物相互作用，我们使用了多组学分析方法，结合微生物和宿主上皮转录组数据。首先，利用DMM模型建立了适合于16S rRNA基因序列数据的两个簇。
• LEfSe分析鉴定到在2个簇差异富集的菌群（补充图E12A），在一个簇中，富集了Streptococcus, Prevotella, Veillonella, Rothia等口腔类群（附图E12B），我们称之为“簇SPT”（颊优势类群）。在另一个簇中，富集了Xanthomondaceae, Staphylococcus, Corynebacterium, Methylobacterium，Granulicatella，我们称之为“簇BPT”（背景优势类群）。肺癌患者的下呼吸道样本更常见的是SPT型微生物群（补充图E11C）。
• 接着我们研究了这两个不同微生物群相关的转录组差异。在SPT和BPT的2458个差异表达基因中，1605个基因在SPT中表达上调。利用IPA进行功能富集分析表明，ERK1／2和PI3K信号通路（补充图E12C）是差异最大的。

 

补充图E12:两个不同的微生物群及其与PI3K/ERK通路上调的联系。

• 随机森林分类器表明，在预测肺癌的菌群中，最丰富的属是Prevotella, Veillonella, Streptococcus。
• CompPLS用于鉴定来自簇SPT的丰富属和肺癌相关信号通路之间的联系。结果在几个口腔常见菌与ERK/MAPK、PI3K/AKT、TGF-β、p53、NFκB和其他癌症相关信号通路之间发现了显著的正相关性（图3）。调整吸烟状态并没有改变模型中的菌群-信号途径关联。确定与癌症相关途径显著相关的最丰富菌群是Megasphaera和Veillonella，这些菌为口腔常见菌，并在肺型SPT中发现。

 

图3：微生物与转录组之间的关联网络

呼吸道上皮细胞与细菌产物的体外共培养

• 探讨队列中细菌暴露与气道上皮细胞转录变化的可能因果关系，我们使用A549细胞进行了三个暴露于微生物产物的体外实验（图4A）。在体外实验1中，我们使用了从对照组一个亚组（n＝8，未涉及疾病）得到的支气管肺泡液中的所有微生物群。这些BAL样品可以分为：1）富含背景优势类群（BPT）；2）富含低细菌载量的颊优势类群（SPT低）； 3）富含高细菌载量的颊优势类群（SPT高），然后，将A549细胞暴露于上述条件（BPT, SPT low , SPT high，PBS control）4小时，随后收获RNA。与PBS相比，BPT没有改变转录水平，然而，在SPT（low and high）中，ERK、IL17、PI3K和VEGF信号通路上调，PTEN信号通路下调（图4B和4C），这表明转录组的改变主要是由颊细菌类群的微生物产物所驱动。
• 接下来我们将呼吸道上皮细胞暴露于SPT类群发现的活菌上清液或热致死细菌中（体外实验2）。暴露于Veillonella上清液或暴露于热灭活细菌都会导致ERK、PI3K和IL17A信号通路的上调（图4B和4D）。LPS和Prevotella或Streptocccus的上清液没有上调PI3K暗示激活途径的差异。有趣的是，Veillonella上清液、热灭活Veillonella和热灭活Prevotella都使IL-1β、IL-18、Casp1和NLRP1上调，表明炎性体可能在这些条件下识别出一些免疫活性微生物产物（图4B）。
• 最后，我们探讨了微生物与香烟烟雾凝聚物（CSC）的结合作用（体外实验3）。首先，单独加入CSC导致芳烃受体信号转导和ERK1/2和PI3K信号通路的上调。在暴露于CSC的A549上皮细胞中添加细菌产物导致ERK1/2相关基因和PI3K信号通路进一步上调（图4B和4E）。综上所述，这些研究结果表明，暴露于口腔常见菌可能会进一步增加转录变化，从而超出香烟烟雾的影响。
• GSEA分析表明，在人群中鉴定的癌症转录组特征与体外转录组数据之间的重叠程度。在体外实验条件下，与人类肺癌转录组变化共同的基因超过100个（图4F），这些基因涉及p53、细胞凋亡、p38 MAPK和EGFR信号通路。

 

 

图4：呼吸道上皮细胞暴露于细菌产物的体外转录激活

研究结论：

1. 癌症患者下呼吸道转录组与对照组相比有显著性差异，包括ERK和PI3K信号通路的上调。

2. 肺癌患者的下呼吸道富含口腔菌群（Streptococcus和Viunnela），这与ERK和PI3K信号通路上调有关。

3. 呼吸道上皮细胞在体外暴露于Veillonella, Prevotella, Streptococcus引起了同样ERK和PI3K通路的上调。