天昊客户新文：茅苍术叶片和根部内生菌定植线索

发稿时间：2018-08-21来源：天昊生物

南京师范大学生命科学学院近期在土壤学领域一区杂志《Plant Soil》上发表了茅苍术叶片和根部内生菌分布的文章。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的扩增子测序工作。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目：Colonization cues of leaf- and root-inhabiting bacterial microbiota of Atractylodes lancea derived in vitro and in vivo

期刊名：Plant Soil     

发表时间： 2018年6月

影响因子：3.052

研究背景: 

微生物群与植物在植物叶片或根系内建立了稳定的共生微生态系统。植物已经进化出了一套微生物群落定植机制来严格地筛选能够进入植物内部的环境微生物。以往的研究表明，由于土壤微生物对根分泌物的趋化作用，土壤和根际微生物群落存在显著差异。因为叶片表面入口点的限制以及和叶片营养成分较少导致空气传播细菌和叶片内生细菌也有区别。植物叶或根可分别从空气或土壤微生物群中选择栖息的微生物群。葡萄微生物区系研究表明，尽管根栖细菌种群与叶栖细菌有显著差异，但栖息于叶、花或葡萄上的细菌与土壤细菌共有的比例要高于它们相互之间共有的比例，这表明土壤细菌可以通过根运输到地上。目前认为土壤微生物的来源是土壤和空气中的微生物。目前还没有直接的证据表明，叶或根栖息的细菌可以在根和叶片之间传递，另外在传递过程中，叶或根是否选择细菌也是未知的。此外，以前的研究已经表明，叶和根栖息的微生物影响植物性状，特别是植物次生代谢产物的产生与叶或根中的微生物群密切相关。在传递和选择过程中，叶片和根中的性状相关微生物群可能对植物代谢系统产生不同的影响。

茅苍术是一种濒危的中草药，具有广泛的药理活性，不仅与植物生长环境的非生物因素有关，而且与植物内生菌和植物的共生过程有关。近年来的研究表明，叶片内生细菌可选择性地从空气中获得，根内生细菌可选择性地来自土壤，我们想知道茅苍术叶片中是否也含有根部内生细菌，同时根部内生细菌是否也含有叶片内生菌。

研究对象：

将茅苍术组培苗1/2 MS培养基中培养1个月。然后将无菌茅苍术组培苗移栽到特殊灭菌实验装置，其可以完全分离茅苍术地上和地下部分（图1）。分离装置的叶室充满空气（自然或灭菌空气），根室充满土壤（自然或消毒土壤）。一个特殊的帽子（允许空气通过，但不允许细菌通过孔径）被拧到所有处理组根室和叶室的端口上。所有实验装置都在超净工作台上安装，以确保在拧帽之前叶室中是无菌空气。每隔5天在在超净工作台上向土壤中添加无菌水（5毫升）。四种处理方法为：SnAn：土壤/空气均自然处理；SnAs：仅空气无菌处理；SsAn：仅土壤无菌处理；SsAs：土壤/空气均无菌处理（图1）。所有处理均有3次生物学重复。九十天后，从四个处理中用无菌剪刀分离植物叶片和根样品。通过连续洗涤和超声处理去尽空气和土壤来源的颗粒和附生细菌获得叶和根组织，然后我们用扫描电子显微镜（SEM）来确定细菌是否仍然附着在叶片和根面上。

图1实验装置的组装及温室实验装置的研究

MiSeq测序：细菌测序区段（V3-V4）； 

研究结果：

研究植物内生细菌起源的受控环境建立

为了研究细菌在叶和根之间的重新定植，我们设计了一种可以分离植物叶和根隔室的受控环境装置（图1）。每个样本测93,282±10,823 原始序列，经过优化过滤后，每个样本获得68,187±7860优化序列。所有样品的Coverage均在99%以上。匹配上植物叶绿体或线粒体16S rRNA序列被过滤掉。空气/土壤无菌处理（SsAs）组的叶和根内生菌在过滤后仍然保留极少数细菌OTU，这表明我们的实验装置可以提供相对无菌的土壤和空气环境。但是空气/土壤无菌处理（SsAs）组的叶片和根内生菌的Shannon多样性指数与其它组别有显著性差异（P＜0.05）。

茅苍术叶片和根内生菌

采用可分离的无菌实验装置检测茅苍术叶和根部隔室中的细菌转移。我们的结果表明在SnAs组（仅空气无菌处理）的叶片或SsAn（仅土壤无菌处理）的根中检测到细菌。在我们的研究中，叶片内生菌在SnAs组（仅空气无菌处理）条件下只可能来自根部内生菌，根部内生菌在SsAn（仅土壤无菌处理）组条件下只可能来自叶片内生菌。因此，我们的研究结果表明，茅苍术的叶内生菌可以传递到根部，根内的细菌也可以被传送到叶片。

此外，还发现叶片和根际细菌在传递过程中具有选择性，SnAs组（仅空气无菌处理）或SsAn（仅土壤无菌处理）组的叶片和根内生菌之间有显著差异（图2A，B）。

同时发现SnAn（土壤/空气均自然处理）和SnAs组（仅空气无菌处理）的根内生菌聚类在一起，这表明从土壤中获得的根内生菌是相似的（图2B）。然而SnAn（土壤/空气均自然处理）和SsAn（仅土壤无菌处理）的根内生菌具有明显差异（图2B），这表明SnAn（土壤/空气均自然处理）和SnAs组（仅空气无菌处理）的根内生菌主要获得自土壤，SsAn（仅土壤无菌处理）的根内生菌主要获得自叶片，它们显著不同。

至于叶片内生菌，结果表明，在SnAn（土壤/空气均自然处理）和SnAs组（仅空气无菌处理）之间，或在SnAn（土壤/空气均自然处理）和SsAn（仅土壤无菌处理）之间的叶片内生菌没有发现明显的差异。SnAs组（仅空气无菌处理）或SsAn（仅土壤无菌处理）组的叶片内生菌之间有显著差异，这说明空气来源和土壤来源的细菌可能同时影响叶片内生菌群的分布。但是SsAn（仅土壤无菌处理）组叶片内生菌与SnAn（土壤/空气均自然处理）和SnAs组（仅空气无菌处理）叶片内生菌非相似度远大于0.37（图2B），这说明土壤来源的细菌对茅苍术叶片内生菌结构有相对较大的影响。

图2不同处理条件下茅苍术叶片和根部内生菌结构差异

茅苍术细菌属与挥发油成分的异同

我们发现了茅苍术叶和根中的15个优势菌属（图3A）。在SnAs组（仅空气无菌处理）中发现了一些叶内生菌属，这些叶内生菌属仅可能来自根。同时，在SsAn（仅土壤无菌处理）中也发现了一些根内生菌属，其中根内生菌属仅可能来自叶。

此外，在不同处理（图3A）中，叶片和根之间的内生细菌属也不同：Stenotrophomonas在叶片中的丰度高于根，而在不同处理下，根中的Cupriavidus更为普遍。这说明叶部和根部对于内生细菌具有一定的的选择性，从而造成不同部位内生细菌的差异。

同时，热图分析还揭示了在SnAn、SnAs和SsAn处理中叶或根中的挥发油具有细微但显著的差异：SnAn（土壤/空气均自然处理）和SsAn（仅土壤无菌处理）的叶片挥发性油谱不同于SnAs组（仅空气无菌处理）。同样，SnAs组（仅空气无菌处理）和SsAn（仅土壤无菌处理）的根挥发油谱不同于SnAn（土壤/空气均自然处理）。

在挥发油谱相似性的RDA分析中，在RDA1轴（图3B）中，基于它们是来自叶或根，样本清楚地聚集在一起，不同的植物部位挥发油不同。然而，在RDA2轴的中，基于来自SnAn, SnAs, SsAn不同处理，样本清楚地聚集在一起。只有四个优势细菌属，Chryseobacterium, Cupriavidus, Flavobacterium, Stenotrophomonas对挥发油谱也有显著影响，Cupriavidus和Stenotrophomonas在RDA1轴上的相关性更大，Chryseobacterium，Flavobacterium在RDA2轴上的相关性更大，综上所述，不同来源的细菌属可能对茅苍术不同组织部位的挥发油代谢过程产生影响。

图3  不同处理条件下茅苍术叶片和根部内生菌的差异以及这些菌属与挥发油谱的相关性

研究结论：

1. 茅苍术叶部内生菌能够由空气中选择性进入，植物根部也可以从土壤中选择微生物进入植物体内。叶片和根系的内生细菌大部分来自土壤，然而，空气来源的细菌种群也部分参与到根部内生细菌种群的构建过程。

2. 不同的植物部位（叶部和根部）对于内生细菌种群具有一定的选择性，最终造成叶部和根部内生菌群的差异。这些特异性选择的内生菌最终对茅苍术的挥发油代谢过程产生影响。