叶绿体基因组测序及其在系统发育和物种鉴定中的应用进展

发稿时间：2018-08-17来源：天昊生物

 

当前，利用二代高通量测序技术对动植物叶绿体、线粒体基因组进行测序，已经取得越来越多的研究成果。该方法无需提纯叶绿体和线粒体基因组，直接从全基因组高通量测序数据中提取并拼接叶绿体和线粒体基因组序列，该方法降低了样本制备、测序等实验难度，缩短了时间，为获得叶绿体和线粒体基因组提供了一种新的途径。今天，小编就跟大家分享两篇近期利用该方法，在植物系统发育分析和DNA条形码物种鉴定方面取得的进展。

 

（一）

  

题目：中国特有尾囊草属叶绿体基因组比较分析及其在叶绿体系统发育和适应性进化中的贡献

发表期刊：Int. J. Mol. Sci. 发表时间：2018-6-22 影响因子：3.687

 

研究内容

尾囊草属（Urophysa）是中国特有的一个属，包括两个种，即距瓣尾囊草（Urophysa rockii）和尾囊草（Urophysa henryi）。在本研究中，研究者采用Illumina测序技术对这两个种及其相关物种天葵子（Semiquilegia adoxoides）的完整叶绿体基因组进行了测序。通过序列比较，阐明了种内和种间变异，推断与其他毛茛科物种的系统发育关系。

 

实验方法

叶绿体基因组测序和组装使用Illumina Hiseq 2500进行测序，用一代测序对缺口进行补测。基因组注释和分析用在线程序DOGMA注释的。用OGDRAW1绘制基因组圈图。重复序列及SSRs分析利用MISA寻找搜索叶绿体基因组中的微卫星基因座。系统发育分析使用 MAFFT、MEGA软件进行。叶绿体基因组核苷酸多样性利用DnaSP软件，正选择分析使用基于优化分支点模型结合贝叶斯经验(BPB)方法。

 

部分研究图表结果

 

 

图1、距瓣尾囊草、尾囊草和天葵子叶绿体基因组图谱。圆圈内显示的基因是顺时针转录的，圆圈外的基因是逆时针转录的。属于不同功能组的基因是彩色编码的。内环中较深的灰色对应于GC含量，较浅的灰色对应于AT含量。SSU:小亚单位；LSU:大亚单位；ORF:开放阅读框

 

 

图2、三种植物叶绿体基因组重复序列分析。(A)共有四种重复类型；(B)回文重复长度的频率；(C)按长度列出的前向重复频率；(D)按长度反向重复的频率

 

 

图3、三种植物叶绿体基因组中SSR分析。(A)在每个物种中检测到的不同SSR类型的数量；(B)确定的SSR类型和频率分析

 

 

 

图4、基于尾囊草属与相关物种的叶绿体基因组共有的79个单拷贝基因的系统发育分析。由(A)最大似然(ML)和(B)最大简约(MP)与贝叶斯推断(BI) 构建的树

 

 

结果与结论

 1、叶绿体基因组概况

• 距瓣尾囊草（Urophysa rockii）、尾囊草（Urophysa henryi）和天葵子（Semiquilegia adoxoides）完整叶绿体基因组大小分别为158512 bp、158303和158340 bp，为典型的四部分圆环分子结构(图1)。大多数基因作为单拷贝出现在LSC或SSC区，而18个在IR区的基因有复制情况。

2、重复序列及SSR分析

叶绿体重复序列是群体遗传学和生物地理学研究潜在有用的遗传资源。对各种叶绿体基因组的分析表明，重复序列对于诱导indels和碱基替换至关重要。

• 以距瓣尾囊草为例，其叶绿体基因组有22个回文重复，23个正向重复，5个反向重复和1个互补重复(图2)。

叶绿体基因组中的SSRs在内部特异性水平上可能是高度可变的，因此在群体遗传和进化研究中经常被用作遗传标记。

• 三种植物的叶绿体基因组中检测到五类完美SSRs (单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸重复序列)，总长度在10到26bp之间(图3 )。

3、系统发育分析

为了研究距瓣尾囊草和尾囊草在毛茛科植物中的系统发育位置，本研究使用了12个毛茛科成员的叶绿体基因组共有的79个单拷贝基因，代表7个属(图4)。

• 利用贝叶斯推断(BI)和最大简约(MP)方法，每个谱系的后验概率和自举值都非常高，所有值≥98 %。最大似然法(ML)、BI和MP系统发育结果都有力地支持了距瓣尾囊草和尾囊草聚在一起，它们的亲缘关系最近，具有100%的自举值
• 每个属形成了一个单一的分支。完整叶绿体基因组序列和CDS序列的拓扑结构与单拷贝基因相似，所有谱系都具有高自举值。

 

  

（二）

 

 

题目：利用完整叶绿体基因组作为超级条形码来鉴定橐吾草本植物

发表期刊：Frontiers in Pharmacology 发表时间：2018-7-3 影响因子：3.831

 

研究意义

橐吾属(菊科)有30多种植物，作为重要的药材一直被使用。由于形态特征和一些DNA区域相同，使得鉴定橐吾属物种仍有困难。由于一些橐吾属植物含有吡咯烷生物碱，这些生物碱对人类和动物健康有害，并且参与肝脏的代谢毒性，因此找到更好的方法来区分这些物种很有必要。

 

实验方法

叶绿体基因组使用Illumina Hiseq X进行测序，用Trimmomatic软件去除低质量reads，SOAPdenovo2组装成contigs，scaffold用SSPACE构建，gaps用GapFiller补。系统进化分析用mVISTA软件对所测叶绿体基因组及参考基因组进行比较，使用MEGA的ML法构建进化树。

 

研究结果

 

 

图1、六种橐吾属植物完整叶绿体基因组的基因图谱。圆圈内的基因是顺时针转录的，圆圈外的基因是逆时针转录的。内圈较深的灰色对应于GC含量，而较浅的灰色对应于AT含量

 

 

图2、L. hodgsonii叶绿体基因组所有蛋白编码基因中20个氨基酸和终止密码子的密码子含量

 

 

图3、使用mVISTA比较六个叶绿体基因组和L. hodgsonii作为参考的序列比较图。比对上方的灰色箭头和粗黑线分别指示基因的方向和IRs的位置。区块使用了70 %相似性阈值，Y刻度代表50 %至100 %相似性百分比

 

 

 

图4、基于六种橐吾和其他25种橐吾的完整叶绿体基因组，使用ML构建系统进化树

 

研究结论

• 本研究通过Illumina高通量测序技术获得的六种橐吾属植物的完整叶绿体基因组。这些叶绿体基因组显示出典型的四部分环形结构，其大小范围从151118到151253 bp。
•  每个叶绿体基因组的GC含量为37.5 %。每个叶绿体基因组包含134个基因，包括87个蛋白质编码基因、37个tRNA基因、8个rRNA基因和2个假基因。
• mVISTA结果没有潜在的编码区或非编码区来区分这六种橐吾属物种，但是这六种橐吾属物种和其他相关物种的最大似然法建树结果显示，整个叶绿体基因组可以作为超级条形码来识别这六种橐吾属物种。
• 这项研究为物种鉴定提供了宝贵的数据，为橐吾的系统进化和安全医疗应用的未来研究提供了可能。

 

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