Genome Biology：IBD患者盆腔囊处宿主基因表达，黏膜微生物和临床结果的相关性分析

发稿时间：2018-05-31来源：天昊生物

 

英文题目： Associations between host gene expression, the mucosal microbiome, and clinical outcome in the pelvic pouch of patients with inflammatory bowel disease

期刊名：Genome Biology             影响因子：11.313

研究背景：

囊袋炎是溃疡性结肠炎（UC）回肠袋肛管吻合手术（IPAA）后常见的并发症，与炎症性肠病（IBD）相似，宿主遗传学和微生物也参与到其发病机制中。本研究对患有溃疡性结肠炎（UC）和家族性腺瘤性息肉病（FAP）的IPAA患者配对活检样本进行宿主转录组和16S rRNA扩增子测序数据分析。

研究流程：

 

研究结果：

宿主上皮组织基因表达、肠组织菌群结构、队列特征和临床表型的多因素联合分析模型

为了更好地了解IPAA手术（IPAA是一种能有效治疗溃疡性结肠炎的手术方式。它通过切除全部大肠以及部分肛管,再用回肠末端做成一个储袋-当成新的直肠用,并与保留下来的肛门括约肌进行吻合，该术式在移除病灶的同时，又能保留正常的排便功能）后宿主和微生物之间的关系，我们在一个大型元数据丰富的横断面队列中，利用微阵列和16S rRNA扩增子测序分别检测了宿主基因表达和菌群结构，队列包括265名患者（51%是女性），年龄在18-78岁之间（表1），手术治疗的UC或FAP患者被纳入其中，所有患者在活检样本收集前至少1年进行IPAA手术。根据临床结果患者分为家族性腺瘤性息肉（FAP）、无结肠袋炎（NP）、急性结肠袋炎（AP）、慢性结肠袋炎（CP）或克罗恩病类炎症（CDL）。大多数患者在囊袋（Pouch，P）和前袋回肠（PPI）处进行了活检，共包括196个PPI 样本和59个pouch样本。

 

表1  IPAA队列的人口统计学和临床特征

组织间宿主基因表达变异度高而菌群变异度低

我们观察到囊袋（Pouch，P）和前袋回肠（PPI）之间的菌群结构类似，但是它们之间的转录水平差异很大。

队列多组学整合的降维方法

为了提高菌群组成与宿主转录活性关联的效率，我们降低了宿主和微生物特征的维数。我们首先计算出，如果微生物丰度和基因表达数据之间的协方差是0.5，使用Bonferroni校正最多执行10 ⁴配对检验，并保留90%的power和α等于0.05，因此非常有必要将19908个宿主转录本和6999个观察到的OTUs减少到10 ⁴次测试，大约是100个转录本和100个微生物clades。为了实现这一目标，首先我们对OTUs分析仅限于那些存在于多个个体并且丰富的OTUs（平均丰度＞0.005）；其次在下游分析之前，我们采用了进一步的无监督和监督策略来进行数据降维，包括多元线性建模（旨在将微生物与宿主相关联）和线性判别分析（确定哪些微生物和转录物能用于临床结果判别）（图1）。

• 对于微生物数据的无监督降维，OTUs通过丰度过滤之后，使用变异度稳定的弧平方转换，然后使用主成分分析将这些过滤后丰富的分支减少到9个主成分分支（cPCs），每个cPC代表一种微生物丰度高度相关模式（图1B下）。
• 对于微生物数据的监督降维，我们通过分层聚类进一步减少了过滤的微生物分支列表，然后选择代表每个聚类的最低平均丰度，最后使微生物分支数减少到45个（图1C下）。
• 对于转录本的无监督降维，首先过滤所有的宿主转录物除去那些在所有受试者中表达变化剧烈的基因。接下来使用主成分分析将剩余的11945个宿主转录本减少到9个转录本主成分（gPCs），每个gPCs代表一种转录本丰度高度相关模式（图1B上）。
• 对于转录本的监督降维，专注于特定感兴趣的宿主基因，特别是那些先前涉及IBD，囊性或宿主-微生物相互作用的宿主基因。因此找到174个IBD相关基因，272个细菌相互作用基因和12个囊性相关基因，这些基因的表达谱分为75个基因中心medoids，每一个代表一个或多个表达相似的基因（图1C上）。

通过这些数据降维方法，我们将19908个宿主转录物和6999个观察到的OTUS转化为138个特征：9个转录本主成分和9个微生物主成分分支，此外还有75个基因medoids和45个微生物分支。

 

图1  数据分析流程图。

组织位置和抗生素使用分别导致宿主基因表达和微生物组成最大变化

为了使gPCs、cPCs、感兴趣的基因中心medoids、炎症、抗生素使用和临床结果之间关系的可视化，我们生成了一个双标图（图2），结果发现抗生素使用与慢性口腔炎（chronic pouchitis）表型和肠球菌（Enterococcus）丰度高度相关。gPC8与抗生素使用呈负相关。克罗恩病类炎症（Crohn’s disease-like）与肠杆菌科细菌（Enterobacteriaceae）增多有关。gPC9高表达与丰富的Sutterella和有益梭菌（Clostridia）相关。gPC1、gPC9、gPC6与FAP和无结肠袋炎（NP）最密切相关。

 

图2 微生物分支、宿主转录本和临床数据的双标图。紫色代表微生物，棕色和蓝色箭头分别代表宿主转录本和临床数据（包括抗生素使用和临床结果，例如FAP、AP、NP），样品根据炎症进行颜色区分，其范围从无（绿色）到高（红色），这个图示仅基于PPI样本。

接着我们量化了被样本位置（囊袋和前袋回肠）、临床结果、抗生素使用和炎症影响的微生物和总宿主转录本的比例（表2），结果发现宿主转录与样本位置密切相关，其次是炎症，而与抗生素使用几乎没有关联，与此相反，微生物的差异与抗生素密切相关，但与炎症或样本位置关系不大。

 

表2 炎症、抗生素、临床结果和样本位置对转录组和微生物的影响

为了进一步研究抗生素、样本位置、临床结果和炎症对特定微生物分支的影响，以及观察这些受影响的微生物分支系统发育关系，我们进行了独立的单变量分析（LEfSe）（图3）。与抗生素使用有关的Bacteroides, Firmicutes, Tenericutes的丰度广泛减少，与抗生素使用有关的Bacilli，Gammaproteo的丰度增加。埃希氏菌属（Escherichia）与炎症呈正相关，放线菌（Actinobacteria）与炎症呈负相关。考虑使用抗生素后，Sutterella属和Bacteroidetes属与FAP临床结果也强烈相关。Actinomycetales，Flavobacteria与PPI弱相关。

 

图3单变量分析中的微生物和临床数据之间的关系。队列中的主要临床数据是抗生素使用，炎症，组织（pouch或PPI），和临床结果（AP，NP，CP，FAP或CDL）。在抗生素使用分层之后，对炎症（环2）、组织类型（环3）和临床结果（环4, 5和6）的影响LDA值分别计算。环的颜色强度对应于LDA效应显著的分类水平，从门（最小强度）到属（最大强度）。

寄主基因表达不是囊袋（pouch）菌群组成的主要决定因素

在数据降维之后，为了检测基因-微生物的关联，使用多元线性模型来控制炎症、组织位置和抗生素使用的影响。监督（curated gene）和无监督（gPC/cPC）列表分别独立地通过MaAsL运行，结果只有无监督列表的结果是显著的（图4）。与cPCs显著相关的gPCs只有gPC8 和gPC9（图4）。gPC9中补体级联（CFI、C2和CFB）、干扰素调节因子1、干扰素诱导鸟苷酸结合蛋白和白细胞趋化因子CCL2的表达减少，预示gPC9高表达可能是对应于较低的炎症状态，事实上，当样品按临床结果分层时，gPC9在克罗恩病炎症患者中表达最低，在FAP患者中表达最高。gPC8中脂多糖激活p38MAP激酶MAP2K6和PLA2G10的表达减少，这两个元件涉及钙和脂肪介导的炎症信号，因此gPC8也可能与炎症有关。

只有四个微生物cPCs与gPC8，gPC9相关：分别是cPC1, cPC3, cPC6, cPC8。cPC1显示了明显与抗生素使用相关的几个特征：肠杆菌科细菌数量增加，拟杆菌属和厚壁菌属广泛减少，肠球菌数量最多（图4）。cPC3具有最低水平的双歧杆菌。cPC1和cPC3与gPC8和gPC9呈负相关, 这些模式表明这组具有抗生素特征的微生物与潜在的炎症基因高表达相关。

总之，宿主转录物和微生物之间的线性关系一般是适度的，占总变异的大约25%，因为其变异主要是由组织位置和抗生素使用分别驱动的。

图4 多元线性模型结果。主成分分析将数据减少到9个gPCs（左侧）和9个cPCs（中间），橙色和蓝色分别表示表达的增加或减少。右侧是同时控制炎症、组织位置和抗生素使用影响后cPCs 和gPCs之间的关联分析。

用宿主-微生物混合模型分鉴定pouch结果

接下来想探讨宿主转录本、微生物或某些组合是否可用于临床结果诊断。因为抗生素使用在临床结果中高度不均衡，并且对慢性口腔炎的预后具有高度预测性，因此我们将分析限制在没有抗生素使用的样本中。慢性结肠袋炎（CP）和克罗恩病类炎症（CDL）可以通过这个模型有效区分，特别是FAP（图5）。然而交叉验证的准确性较低（AUC 0.57），主要是由于模型对AP和NP结果的低区分度造成的。

 

图5针对临床结果的线性鉴别分析。使用线性鉴别分析来确定在控制抗生素使用后，哪些基因和微生物在临床结果上最具鉴别力。在分析之前除去抗生素使用的所有样品，并使用LDA混合模型进行一次性交叉验证。（A，B）使用LD1和LD2鉴别临床结果。

研究结果：

• 这项研究量化了炎症、抗生素使用和活检位置对囊袋菌群和宿主转录组的影响，发现宿主转录物主要与活检部位和炎症相关，而微生物主要与抗生素使用相关。
• 宿主转录物和微生物之间的线性关系一般是适度的，只占总变异的大约25%，因为其变异主要是由组织位置和抗生素使用分别驱动的。
• 与微生物最相关的宿主转录过程是补体级联基因和白介素-12通路。
• 这些宿主转录过程的激活与Sutterella, Akkermansia, Bifidobacteria, Roseburia丰度呈负相关，与Escherichia丰度呈正相关。