Microbiome：结直肠癌宏基因组多队列分析鉴定到人群间的细菌改变和通用细菌标记

发稿时间：2018-04-26来源：天昊生物

英文题目： Multi-cohort analysis of colorectal cancer metagenome identified altered bacteria across populations and universal bacterial markers

期刊名：Microbiome            发表时间： 2018.4          影响因子：  8.496

背景：不同人群中肠道菌群的改变与结直肠癌（CRC）相关,目前发现几种细菌有助于肿瘤的发生，对于肠道微生物作为早期诊断标志物的潜在应用也有报道。然而，队列特异性噪声可能会扭曲CRC中微生物失调的结构，并导致研究结果不一致。本研究旨在探索不同人群间种水平上普遍改变的肠道微生物群落。

研究结果：

队列间微生物群落组成

我们积累了来自四个队列，美国（USA）、奥地利(AT)、中国（HK）、德国和法国（FD），包括271个对照组和255例CRC（人口统计学、临床和技术细节，如表1所示）的宏基因组测序序列。

表1 粪便样品的人口学、临床和技术细节

USA、AT和FD队列中CRC病例和对照组间香农多样性指数差异不显著，然而，与HK队列对照组相比，病例组多样性指数显著降低。主坐标分析确定了不同群体间细菌组成存在显著差异（图1a: control; 图1b: CRC），还发现CRC病例和对照组间细菌总体组成有显著差异（图1c）。

图1. 不同人群间微生物组成和统计差异。a-c:对照样本、CRC样本和所有样本各自的主坐标分析。d: 检测不同丰度细菌（不同细菌丰度变化程度(fold change=10, 20, 40%)vs队列样本大小（对照样本数×病例样本数））的统计功效。

队列间CRC和对照组丰度差异细菌

进行了模拟分析，比较了meta分析和单队列研究之间的统计功效。模拟分析表明，细菌丰度变化20%时估计功效为0.88；单一队列研究细菌丰度变化倍数为20%时估计功效则为0.5，这显示队列间优于单一队列研究（图1d）。利用meta分析来鉴定4个队列间CRC和对照组丰度差异细菌。使用秩和法，确定了7个CRC富集菌种和62个CRC减少菌种（图2a）。在这七个CRC富集菌种中， Bacteroides fragilis在所有四个人群中始终富集，而五个细菌(P. asaccharolytica, P. micra, P. intermedia, A. finegoldii, and T. acidaminovorans)在四个队列中的两个其丰富度表现出明显的变化（图2b）。在62个CRC减少细菌中有五种细菌被报道对健康有益，包括Clostridium butyricum, Streptococcus salivarius, Streptococcus thermophilus, Carnobacterium maltaromaticum, Lactobacillus gallinarum。为了确定这69个CRC相关细菌是否与CRC进程相关，我们研究了它们在CRC早期和晚期阶段中的丰度差异，3种细菌（Streptococcus sp. I-G2, Shewanella woodyi, Mycoplasma penetrans）对照组、早期CRC和晚期CRC呈下降趋势。

图2. 不同群体中CRC丰度差异的细菌。a 最大变化程度的7个CRC富集菌种和20个CRC减少菌种（左图）, 个体配对变化程度的置信区间（右图）。b 7个CRC富集细菌在不同群体中的丰度。c 基于7个CRC富集菌种的SVM模型预测能力。

使用细菌标记物区分CRC和对照组

为了区分CRC患者和对照组，将七个CRC富含细菌物种装配到（SVM）模型中。获得的USA, AT, HK, FD 队列AUC曲线面积分别为0.83, 0.87, 0.84, 0.82。所有人群样本的AUC为0.80。当把临床表型信息（年龄，性别和体重指数）纳入以后，总的AUC增加到0.88（图2c）。七个CRC富集菌种在AT，HK和FD队列中区分早期CRC病例和对照的AUCs分别为0.84、0.82、0.84，提示其在早期CRC病例和对照之间的杰出分类性能。

CRC相关细菌之间的相关性

为了从生态学的角度深入了解细菌与细菌的相互作用，进一步研究。基于SparCC算法调查了CRC富集菌与CRC减少细菌之间的相关性。观察到CRC富集和减少的细菌分别形成了各自的共生网络，彼此呈负相关。有趣的是：CRC减少细菌中显著相关对的数量和相关强度在对照组高于CRC病例组（图3b）。CRC富集细菌和CRC减少细菌之间大多数是负的。七个CRC富集菌在CRC早期比CRC晚期的相关性更为密切，它们之间相关网络在CRC后期被破坏了。以加权程度为中心，发现梭状芽孢杆菌（Clostridium）在网络中中心性最高，这些中心物种可能在网络中起关键作用，与去除随机节点相比，当去除梭菌物种的节点时，网络连通性急剧下降。

图3 CRC相关细菌之间相关性的Meta分析。a  CRC样品中69个CRC富集或减少细菌之间的相关性。圆之间的相关节点用深蓝色标记。四个CRC富集的口腔菌种用暗红色标记，五个共生细菌以三角形表示，节点的大小与它们对应的中心性成正比。b CRC减少细菌的相关网络在对照组和CRC组之间的比较。

CRC富集和减少细菌相关的功能基因家族

将宏基因组序列映射到UniRef数据库，使用HUMAnN2将其分为10675个GO和8695 个 KO。共有311个GO分类和217个KO发现在CRC中富集， 31个GO和74个KO在CRC中减少。使用Spearman调查了七个CRC富集物种和GO/KO之间的相关性，确定了167个GO和143个KO与CRC富集细菌有显著的正相关（图4），我们定义了这些GO/KO为CRC富集细菌相关的GO / KO类别。为了研究相关的功能途径，我们将KO分类映射到KEGG通路，参与同一途径的KO被视为相关KO类别。鉴别了与癌症发展相关被多个KO共享的通路，发现了7个KEGG通路在CRC中富集（图4）。一些共生细菌被发现与CRC减少的GO/KO类别相关：Clostridium butyricum，Carnobacterium maltaromaticum与GO051606（刺激检测）密切相关；Streptococcus salivarius， S.thermophiles分别与K07104（邻苯二酚2,3-双加氧酶）和K07570（一般应激蛋白13）相关。

图4  CRC富集细菌与KO之间的相关网络。相同颜色的节点共享相同的CRC富集路径。

结果总结：

• 基于来自中国、奥地利、美国、德国和法国队列的526个宏基因组样本的组合分析，在不同人群间鉴定到七个CRC富集的细菌(Bacteroides fragilis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas asaccharolytica, Parvimonas micra, Prevotella intermedia, Alistipes finegoldii, and Thermanaerovibrio acidaminovorans)。
• 七个富集的细菌标记使用AUC曲线可以将不同人群间的对照和病例区分开。
• 丰度相关分析表明，CRC富集和CRC减少的细菌分别形成了自己的共生网络。
• 发现CRC富集的细菌与脂多糖和能量生物合成途径相关。

结论：

•    本研究发现潜在的细菌诊断标志物在人群间是稳健的，提示其在无创性CRC诊断中的潜在应用价值，本研究还阐明了CRC相关微生物群的生态网络和功能容量。