天昊目的区域甲基化MethylTarget®检测技术动物领域再发新文

发稿时间：2018-04-12来源：天昊生物

继天昊MethylTarget^®多重目的区域甲基化富集测序技术动物领域首发文章后，南京农业大学动物健康与食品安全国际合作联合实验室利用MethylTarget^®技术近期又在《Comparative Biochemistry and Physiology》杂志上发表了母鸡补充甜菜碱通过DNA甲基化修饰来调控F1代公鸡下丘脑胆固醇代谢相关基因表达的文章。在恭喜客户又发表文章同时，我们再跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目：Dietary betaine supplementation in hens modulates hypothalamic expression of cholesterol metabolic genes in F1 cockerels through modification of DNA methylation

中文题目：母鸡补充甜菜碱可以通过DNA甲基化修饰来调控F1代公鸡下丘脑胆固醇代谢相关基因的表达

期刊名：Comparative Biochemistry and Physiology, Part B     影响因子： 1.757

技术：MethylTarget^®多重目的区域甲基化富集测序技术

实验描述如皋黄羽蛋鸡随机分为基础饲料组和补充甜菜碱(0.5%)喂养组，喂养30天后，收集鸡蛋进行孵化，孵化的小鸡相同条件下生长56天，然后进行称重和取样。取颈静脉至肝素抗凝管，3000×g离心，4°C 10分钟制备血浆。解剖下丘脑，迅速在液氮中冷冻，然后储存在−70°C作进一步分析。

研究目的: 

甜菜碱广泛应用于动物营养，作为蛋氨酸代谢中的甲基供体可通过基因表达调控实现营养重编程。目前不清楚蛋鸡喂养添加甜菜碱的饮食是否会影响F1代下丘脑的胆固醇代谢。

研究结果：

血浆和下丘脑胆固醇含量

母鸡补充甜菜碱并没有改变体重，但是F1公鸡血浆总胆固醇和高密度脂蛋白（HDL-C）浓度显著增加，此外，母鸡喂养甜菜碱可显著增加F1公鸡下丘脑总胆固醇和胆固醇酯含量（表3）。

表2  体重；血浆中总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量；下丘脑中总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量。Tch：总胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白；BW, 体重； Free Cho：游离胆固醇；Cho Ester：胆固醇酯。

下丘脑胆固醇代谢基因的表达

母体喂养甜菜碱显著上调下丘脑SREBP1, SREBP2, LDLR 转录水平（图1A）和蛋白水平（图1B）。在甜菜碱组HMGCR mRNA水平增加，而CYP46A1 mRNA水平下降。此外，在甜菜碱组ACAT1和APO-A1 mRNA水平均明显升高。

图1 母体补充甜菜碱对F1代下丘脑胆固醇代谢基因表达的影响。A.下丘脑中SREBP1, SREBP2, HMGCR, CYP46A1, ACAT1, APO-A, LDLR mRNA水平。B. SREBP1, SREBP2, LDLR蛋白水平。

下丘脑甲基转移和神经肽相关基因的表达

母体喂养甜菜碱可在转录（图2A）和蛋白水平（图2B）上使BHMT和DNMT1表达明显增加。此外，与对照组相比，甜菜碱组中下丘脑BDNF和CRH mRNA水平表达显著下调，而NPY mRNA表达显著上调（图2C）。

图2  补充甜菜碱对F1代下丘脑甲基转移和神经肽相关基因表达的影响。A.下丘脑BHMT, DNMT1,DNMT3A mRNA表达水平。B. 下丘脑BHMT, DNMT1,DNMT3A 蛋白表达水平。C. BDNF, NPY, CRH mRNA表达水平。

下丘脑SREBP1, SREBP2, APO-A1等基因启动子CpG甲基化

对下丘脑基因组DNA进行了MethylTarget^®技术分析（mean coverage of> 600×），结果发现SREBP1, SREBP2, APO-A1等基因启动子区CpG岛甲基化状态受母体喂养甜菜碱调节。SREBP1(−1350 to −1199), SREBP2 (−2030 to −1612), APO-A1 (−725 to −505)等基因的近端启动子区被用于甲基化分析（图3）。SREBP1启动子区段包括包含11个CpG位点，这些CpG位点在甜菜碱组相对于对照组都是低甲基化。SREBP2启动子区段包括包含4个CpG位点，其中3个CpG位点在甜菜碱组相对于对照组是低甲基化的， 另外1个CpG位点则是在甜菜碱组高甲基化。APO-A1启动子区段包括包含5个CpG位点，这些CpG位点在甜菜碱组相对于对照组都是低甲基化。总的来说，SREBP1, SREBP2, APO-A1所检测的3个片段平均甲基化程度在甜菜碱组明显降低，这与它们的mRNA丰度呈负相关。

图3  F1代下丘脑SREBP1,SREBP2,APO-A1基因启动子甲基化状态。 SREBP1 (−1350–−1199), SREBP2 (−2030–−1612)和APO-A1 (−727–−505) 5’侧翼启动子序列示意图。SREBP1, SREBP2, 和APO-A1 启动子区域平均甲基化状态（左图）和差异甲基化CpG位点（右图）。

总结：◆

•  甜菜碱组血浆总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇含量显著升高，下丘脑中总胆固醇和胆固醇酯含量也显著升高。
• 相应的，下丘脑SREBP2, HMGCR, LDLR, SREBP1, ACAT1，APO-A1等基因表达显著上调，CYP46A1表达上调，这些变化与BDNF和CRH表达显著下调以及NPY表达显著上调有关。
• 此外，参与甲基转移循环的基因也被调控，例如DNMT1和BHMT的mRNA和蛋白水平都显著上调，这与SREBP-1, SREBP-2，APO-A1等基因的启动子CpG甲基化明显修饰相关。
• 这些结果表明，蛋鸡喂养甜菜碱可以通过启动子DNA甲基化修饰来调控F1代公鸡下丘中参与胆固醇代谢和脑功能相关基因的表达。

天昊创新性MethylTarget^®多重目的区域甲基化富集测序技术：

• 性价比高：传统克隆测序一个片段10个克隆的价格，MethylTarget可以完成约60个片段的检测（检测深度为1000X，相当于1000个克隆）
• 精确度高：基于二代测序数据检测甲基化程度，精确到单碱基分辨率，与基于测序的全基因组甲基化测序，RRBS数据有高度一致性
• 精确定量：测序深度高达1000X，并可以进一步加深，相比于传统克隆测序，可以对位点甲基化程度进行准确定量
• 技术灵活：基于多重PCR富集进行目标区域富集，可随时进行基因和位点的变化和改动，并且可以获得每个片段的甲基化单倍型