Microbiome：绵羊上呼吸道和下呼吸道微生物比较分析

发稿时间：2017-11-21来源：天昊生物

 

英文题目： Comparing microbiotas in the upper aerodigestive and lower respiratory tracts of lambs

中文题目：绵羊肺部微生物

期刊名：Microbiome           

发表时间： 2017.10.27     

发表单位：英国爱丁堡大学罗斯林研究院和皇家（迪克）兽医研究学院

研究背景

最近，在人类和动物模型中研究了肺微生物在健康和疾病中的重要性。在人类中，最近已证实，肺部微生物是由口腔微生物而来的，因此本研究想确定绵羊是否相同。                             

研究对象

40只羊羔（20只雄性和20只雌性）的肺液和上呼吸消化道（口咽）的拭子样本：平均年龄：48.8 天 ± 0.8，平均体重: 20.6公斤±2.6。在安乐死之前，唯一的食物来源母羊的乳汁和牧草。

样本取样

1）口咽取样：羊羔被实施安乐死然后从农场运送到解剖室，使用棉拭子进行口咽取样，拭子储存在保护性塑料套中，拭子在采样点前后擦拭一次，然后拭子转移到另外一个新的保护性塑料套中（内含500μL PBS）并储存在冰上。口咽拭子存储在−80°C直到下一步的DNA提取。

2）肺液取样：颈部的腹面被剃光，使用无菌手术刀切开皮肤及皮下组织然后暴露腹面气管，在暴露的腹面部位确定一个采样点，采样点气管使用结扎线和钳夹法完全封闭。选定的采样点加热烧灼，将50毫升PBS经烧灼部位注入气管腔，PBS会流下胸部的尾部，第二个夹子立即放在注射部位尾部，以防止倒流、渗漏和潜在污染。将羊羔尸体倾斜，使PBS流向肺部，然后翻倒，液体聚集在气管腔内直到到第二个夹子的位置。在气管的腹表面烧灼选择一个取样点，然后用针头和注射器收集汇集液。每个样本平均收集4 ± 1.7 ml肺液，然后放在冰上，肺液13000g离心5分钟，弃上清液，沉淀用500μL PBS悬浮。肺液被存储在−80°C直到下一步的DNA提取。

技术手段

16S rDNA扩增子测序（V2–V3）

研究结果

1、 方法质控

平均每个样本得到138,125 ± 29,306条序列，共得到750个OTUs，Good’s coverage指数为99.9%，表明样本中99.9%的细菌被鉴定到。

2、 羔羊口咽拭子分为两种不同群落类型

使用拉普拉斯近似分析可以将40个羔羊口咽拭子样本基于细菌种类分为两个独立组：口咽型拭子和瘤胃型拭子（图1, 2），口咽型拭子主要由巴斯德菌科(22%), 曼氏杆菌(14%),梭杆菌 (11%), Bibersteinia trehalosi (8%), 奈瑟杆菌(7%), 莫氏杆菌(6%), 比伯斯坦杆菌 (5%) 。而瘤胃型拭子主要包括普雷沃菌属（36%）、梭菌目（11%），疣微菌科（7%）、毛螺菌科（6%）和丁酸弧菌属（6%）。口咽型拭子和瘤胃型拭子在微生物多样性方面没有显著差异。

3、 叉状分枝的口咽菌群与不同肺菌群结构相关

肺液样品最常见的OTUs是马胃葡萄球菌;（13%），金黄色葡萄球菌（6%）、曼氏杆菌（5%）和普雷沃菌属（5%）。使用拉普拉斯近似分析肺液没有像口咽样本分成2个组，然后手工将肺液分成与拭子各自相同的两组：口咽型和瘤胃型（图1, 2）：例如普雷沃菌和鞘氨醇杆菌是羊羔指示菌，其来源于瘤胃型拭子，噬氨副球菌也是羊羔指示菌，其则来源于口咽型拭子。比较了瘤胃型拭子中优势OTUs比例和其在肺液样本中的相应比例：平均而言这些OTUs在肺中的比例如下：普雷沃菌（5%）、梭菌目（2%），Ruminococcaceae（3%），毛螺菌科（1%）和丁酸弧菌属（1%）。总体看来，羊羔肺部菌群与口咽菌群结构不同。

 

图1  PCOA 分析显示羔羊口咽拭子样本基于细菌种类分为两个独立组（红色和紫色），肺液样本分成相同的组（绿色和橙色）。肺液样本和口咽样本明显分别聚集。

 

图2  羊羔肺液、口咽拭子，提取试剂盒和PBS对照组发现的OTUs。绿色：划分瘤胃细菌群落的口咽拭子；红色：划分口咽型细菌群落的口咽拭子；粉红色：划分瘤胃细菌群落的肺液；蓝色：划分口咽型细菌群落的肺液

4、 肺特有菌群的存在

指示菌种分析确定数个OTUs在肺液中相对于口咽拭子更显著富集（表2）。开始认为试剂污染是导致的这个结果，因为相对于口咽拭子样本，试剂污染会对肺液样本产生更大的影响，由于其较低的生物量。然而当检查指示菌种时，发现大多数样品中这些OTUs的比例并不完全相同。在这些指示菌种，最常见的是葡萄球菌，其在肺液中的比例为13.3%，其在对照组和口咽拭子样本中比例非常少。

表2  示菌种分析确定数个OTUs在肺液中相对于口咽拭子更显著富集

 

结论

●  口咽拭子样本通常被与瘤胃常见细菌（瘤胃型）或上呼吸消化道常见细菌（口咽型）所主导。

●  肺部微生物不同于上呼吸消化道或对照，在肺液中发现了一些瘤胃相关细菌，表明其确实吸入了瘤胃细菌。

●  还发现了几种细菌，它们在肺液中比上呼吸道分泌物中更丰富，其中最主要的为葡萄球菌。

●  与人类相反，发现羊羔肺部与上呼吸消化道菌群并不相同，认为这可能与绵羊与人类生理和解剖学上的差异有关。