Microbiome：胰腺囊肿液具有独特的微生物云

发稿时间：2017-11-14来源：天昊生物

副标题：胰腺囊肿液具有独特的微生态系统

英文题目： Pancreatic cyst fluid harbors a unique microbiome

中文题目：胰腺囊肿液具有独特的微生物

期刊名：Microbiome            发表时间： 2017.11           影响因子：  8.496

发表单位：荷兰伊拉兹马斯大学鹿特丹医学中心胃肠病学和肝病学系

研究对象：在进行超声内镜引导下细针穿刺活检（EUS-FNA）时收集 69疑似囊性病变患者的胰腺囊肿液（PCF）：1）27例胰腺导管内乳头状腺瘤(IPMN)患者：2例主分支型IPMN患者；4例弥漫型IPMN患者；12例单病灶侧分支IPMN患者；4例多病灶侧分支IPMN患者；5例未确定类型IPMN患者；2）13例粘液性囊性肿瘤（MCN）患者；3）9例胰腺假性囊肿患者；4）9例浆液性囊腺瘤（SCA）患者；5）11例具有明显多种形式的囊性病变，胃肠间质瘤（GIST），神经内分泌肿瘤（NET），或没有明确的临床诊断，这11例患者定义为其它。胰腺囊肿液存储在−150°C。

表1胰腺囊肿患者的临床及病理特点

 

DNA提取试剂盒：300 μl的胰腺囊肿液用于DNA提取，试剂盒为Wizard DNA isolation kit (catalog no. A1620, Promega BNL B.V)

技术手段：16S rRNA 扩增子测序（V3-V4）

研究背景： 很明显，特定的肠道细菌参与胃肠道不同癌前病变的发展。然而对胰腺囊性病变微生物成分的分析尚未完成。这就促使我们探讨内镜下获得的胰腺囊肿液体（PCF）是否含有细菌，并确定该材料中存在的细菌属。

研究结果：

1、 细菌DNA存在于EUS-FNA收集的胰腺囊肿液中

目前尚不清楚胰腺囊液是否有微生物成分，通过16S rRNA PCR分析发现69例胰腺囊肿液样本中有64例存在细菌DNA（表2）。囊肿液中细菌DNA的存在与病变类型无显著关联：在粘液性囊性肿瘤（MCN）患者中，100%样品含有大量细菌DNA；在IPMN样本，92.6%样品含有大量细菌DNA；在假性囊肿和浆液性囊腺瘤，88.9%样品含有大量细菌DNA；在其它组，90.9%样品含有大量细菌DNA。

表2使用PCR，Sanger测序和NGS确定胰腺囊肿液中的细菌生态系统特点

 

2、 不同临床类型胰腺囊肿液的微生物组成

16S rRNA通用引物PCR产物的Sanger测序结果显示69个样品中有13个样品存在Fusobacterium spp.（梭菌属）。PCF中另一个主要细菌是Bacillus spp.（芽孢杆菌），69个样品中有16个样品都存在这个菌。另外还检测到的细菌包括：Ruminococcus spp., Staphylococcus spp., Caldimonas spp., Arthrobacter spp., Acinetobacter spp., Bacteroides spp., Orpinomycesspp., Anaerococcus spp.（表2）。

为了确认这些细菌存在和深入了解PCF中的细菌组成，16S rRNA基因拷贝数最高的23个PCF样品进行了16S rRNA （V3-V4） 扩增子测序。结果发现：丰度最高的菌属分别是：Bacteroides（类杆菌属）, Escherichia（埃希氏菌属）/Shigella（志贺氏菌属）,  Acidaminococcus（氨基酸球菌属）（图2）。不同类型的囊肿在微生物组成上无统计学差异。另外不同组别的多样性指数也相似（图3）。

 

图2. 33个胰腺囊肿液体样品微生物属的分类组成。a 浆液性囊腺瘤（SCA）微生物组成; b胰腺导管内乳头状腺瘤(IPMN)微生物组成；C胰腺假性囊肿微生物组成；d粘液性囊性肿瘤（MCN）微生物组成;

 

图2. 胰腺囊肿液体样品的微生物多样性香农指数。

3、 囊肿类型和切除术后的多样性

不同类型囊肿之间、切除组与非切除组之间、癌胚抗原（CEA）和癌抗原19.9（CA19.9）之间微生物多样性指数也相似。这个结果与不同类型囊肿16S rRNA通用引物PCR产物的Sanger测序结果一致。

4、 胰腺囊肿液微生物组成表明其是一个独特的生态系统

将PCF细菌组成和人类微生物组计划（HMP）13个不同身体部位微生物组成进行比较发现：与粪便比较时，PCF具有26种独特的细菌基因型；与喉道比较时，PCF具有27种独特的细菌基因型；与舌背比较时，PCF具有28种独特的细菌基因型；另外PCF中有36种独特的细菌基因型不存在于任何其它身体部位（图4）。

 

图4. 胰腺囊肿具有一个与其它人体不同的独特微生物组成。与其它身体部位相比，使用二项式检验和ANOVA 检验发现PCF中存在27-314种差异细菌基因型。

ANOVA分析（确定细菌种群的影响大小）发现：将PCF细菌组成和HMP不同身体部位细菌组成进行比较时有314细菌菌群具有影响大小的变化，高影响菌种如图5所示，这个结果说明PCF含有独特的微生物组成，但是唯一性不能归咎于某个单一的菌属。

 

图5. 单个菌属对PCF独特性的贡献。相对于其他13个身体部位，PCF中的82个丰度差异菌属以及对PCF独特性的相对贡献。

相对于其他13个身体部位，PCF中存在相对高丰度和低丰度的特异菌种：PCF中有17种丰度较高的特异菌种，如拟杆菌属、埃希氏菌属/志贺氏菌属、普氏菌属、氨基酸球菌属属、鞘氨醇单胞菌属、双歧杆菌属等，这些细菌被证明在结肠、肺和肝癌的发生和发展中起作用。另外有15种细菌菌属在13个身体部位丰度较高：链球菌属、丙酸杆菌属、乳酸杆菌、梭杆菌属、棒状杆菌属、韦荣氏球菌属、奈瑟菌属、葡萄球菌属等，这些菌同时也是PCF中存在最少的细菌。这个比较说明PCF中定植的细菌是独一无二的，PCF存在的高丰度菌属具有在癌微环境中繁殖和喂食肿瘤的倾向（图6）。

 

图6. 相对于其他13个身体部位，PCF中存在相对高丰度和低丰度的特异菌种

结论：

•  观察到常规PCR的检出率为98.2%，而使用NGS的胰腺囊液（PCF）细菌检出率则高达100%。
•  相对于其他13个身体部位，PCF中有17种丰度较高的特异菌种，如拟杆菌属、埃希氏菌属/志贺氏菌属、氨基酸球菌属属等菌属。
•  这些结果揭示了胰腺囊液中存在一个明显特异的细菌生态系统。这其中包括一些具有潜在有害功能的细菌类群，这表明在这一生态位的独特微生物有可能促进胰腺肿瘤进程。