SSR在基因精细定位中的应用

发稿时间：2017-10-30来源：天昊生物

摘要： SSR与精细定位

SSR (Simple Sequence Repeats，简单序列重复)是一种常用的遗传分子标记。之前小编给大家介绍了SSR在遗传多样性、群体结构和性状关联分析中的应用（学会工具“三件套”，SSR分析不再难）。除此之外，SSR还可以在基因的精细定位中发挥作用。

要做到“精细定位”，既需要该区间存在足够多的分子标记，又需要有足够多的重组事件发生，二者缺一不可。没有足够的分子标记，就无法进一步缩小区域范围；没有重组事件发生，则无法衡量分子标记与目标基因的距离。要获得高密度的标记，通常需要在基因组或者转录组测序获得序列信息后，利用相应生信工具进行标记开发；要增加重组事件发生，往往要靠扩大群体来实现。下面小编就以大豆花叶病毒（SMV）抗性基因精细定位为例，跟大家分享两篇近期发表案例。

1、大豆花叶病毒新的抗性基因Rsc15的精细定位及鉴定

 

发表时间：2017年8月  发表期刊：Theor Appl Genet. 影响因子：4.132

研究背景：

大豆花叶病毒是一种严重危害大豆产量的病害，前期研究发现有些大豆品种具有很强的抗病表型，后发现多个抗病基因（Rsv1,Rsv3, Rsv4,Rsc3,Rsc4,Rsc7,Rsc8, Rsc14）。作者前期发现一个新的基因Rsc15，本文在此基础上利用构建的RIL群体对其进行精细定位。

样品选取：

抗病品种RN-9与易感品种7605杂交后的F1、F2 (315个单株)及RIL群体（216 个F_7:11个株系植株）。

SSR标记的选择：

15个SSR标记用于初定位结果的验证 (Satt640, Satt227,Sat_153, Satt322, Sat_213, Sat_246, Satt286, Satt277,Satt557, Satt658, Satt100, Satt708, Sat_238, Staga001, Satt433)，132 SSR标记用于精细定位（108个区域SSR标记+用SSRHunter软件新开发的24个SSR标记）。

表型鉴定：

表1、不同群体材料抗病性表型鉴定

 

表1结果表明，F2群体抗病和不抗病植株为3:1，RILs群体抗病和不抗病植株为1:1，经过卡方检验，与孟德尔分离比率一致，表明该性状主要有一个主效基因控制。

利用RIL群体进行精细定位：

 

图1、遗传连锁图谱

前期研究，将Rsc15初步定位在6号染色体Sat_213和Satt286之间的14.6 cM (~1.6 Mb) 区域（图1）。通过在父母本植株中对132个SSR多态性检测，发现18个SSR具有多态性，用于216个RIL群体株系基因型检测，最终利用Join Map 4.0及MapChart 2.2软件构建遗传图谱，根据最小对数似然比LOD为3建立连锁群，最终把Rsc15定位在了SSR_06_17和 BARCSOYSSR_06_0835之间（图1）。

 

图2、SMV抗性基因（Rsc15）的遗传和物理图谱

通过分析标记在大豆Williams 82参考序列 (Glyma Wm82.a2.v1)中的位置，确定了Rsc15位于95Kb的一段区域内（图2-c），包含5个预测基因，通过测序发现只有 GmPEX14(Glyma.06g182600)具有多态性，除此之外，侧翼区域的Glyma.06g175100, Glyma.06g183500 和Glyma.06g184400也具有多态性，也归为潜在的候选基因（图2-d, 表2）。

表2、候选基因列表

 

后面通过在不同组织及不同病毒处理时间下候选基因表达检测，以及对抗逆相关的H₂O₂浓度、CAT和POD活性检测，最终发现它们之间存在着高度的相关性（图3）。

图3、RN-9中GmPEX14表达水平与H₂O₂浓度、CAT和POD活性的相关性分析

文章总结：

整篇文章从新SSR分子标记的开发、扩大的RIL群体构建，到从抗病表型和基因型检测，再到精细定位后候选基因表达及后续功能分析一气呵成，还是比较完整的一篇文章。美中不足就是在功能方面，如果能将抗病品种RN-9中的GmPEX14转到易感品种7605中，并分析其抗病能力的话，文章将更上一个台阶。

2、具有SMV抗性的大豆品种Suweon97相关基因Rsv1-h的精细定位

 

发表时间：2016年8月  发表期刊：Theor Appl Genet. 影响因子：4.132

样品选取：

对SC6-N 和SC7-N具有抗性的抗病品种Suweon 97与易感品种Williams 82，及其杂交后的F1、F2 (267个温室种植单株及1150个大田种植单株)、F_2:3（73个单株）和F_3:4（13个株系）群体。

 

图4、精细定位流程图

SSR标记的选择：

在13号染色体的之前定位的Rsv1区域发现有128个SSR标记，22个在父母本中显示出多态性。

表型鉴定：

表3、F2群体抗病性表型鉴定

 

表3结果表明，F2群体抗病和不抗病植株为3:1经过卡方检验，与孟德尔分离比率一致，表明该性状主要有一个主效基因控制。

 

为了验证是否真正连锁，选用13_1103和13_1187两个标记对1,150 F2单株进行群体基因型检测，在Suweon 97和Williams 82中具有相同基因型的分别记为1103^SS1187^SS和1103^WW1187^WW，最终分别得到262株和285株。自交后得到F3代，随机选取100粒种子种植后进行抗病表型检测，最终验证了之前的连锁结果（图4）。

 

图5、重组F2代单株基因型物理图谱及对应F_2:3植株抗病表型

此外，还检测到529株F2^1103SW1187SW杂合植株，另外74株在13_1103和13_1187两个标记之间发生重组（1103^SS1187^WW或1103^WW1187^SS），然后利用剩余20个SSR对这74个重组植株进行基因型检测，进一步寻找重组交叉点，最终将Rsv1-h定位在Suweon 97品种的13_1114和13_1115附近区域（图5）。

 

 

图6、13个重组F_3:4株系基因型物理图谱及对应抗病表型

种植13个F_2:3株系，选取在重组位点左右两段均为纯和且分别来自父母本的F_3:4进行表型鉴定，进一步验证了Rsv1-h在Suweon 97品种的13_1114和13_1115附近区域（图6）。

表4、候选基因列表

最后，本研究根据定位到的~97.5Kb区域进行基因组分析，寻找到8个可能的候选基因，其中2个可能与抗病有关。文章并未对基因的功能进行深入探讨。

 

通过对以上两篇文章的解析可以发现，利用SSR分子标记进行基因精细定位的思路十分清晰：构建群体，筛选有多态性的SSR，基因型及表型分析，遗传及物理图谱定位，根据基因组信息列出候选基因，进行表达量等功能分析。思路流程理清了马上开始着手实验，一篇4分多的文章就在不远的前方！

 

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