WGS分析美国耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的传播和进化

发稿时间：2016-09-06来源：天昊生物

英文题目：Transmission and microevolution of USA300 MRSA in US households: evidence from whole-genome sequencing

中文题目：全基因组测序证实美国家族中USA300耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株的传播和进化

期刊名： mbio     发表时间： 2015,3      IF：6.975

单位: 美国芝加哥大学医学部感染性疾病与全球卫生部门 

技术： Whole-genome sequencing

测序平台： Illumina Hiseq 2000

材料： 146个芝加哥和洛杉矶USA300MRSA分离株、35个圣地亚哥USA300MRSA分离株、277个纽约USA300MRSA分离株

分析方法： denovo组装/贝叶斯进化树/ ML系统发育树构建

研究背景: 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300是美国重症监护患者发生迟发性院内获得性肺炎的一个重要原因，其作为一个有毒的，易于传播的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，是美国家族中和MRSA菌株相关的最主要类群，这些细菌极易引起皮肤感染，坏死性肺炎和心内膜炎等。研究者使用全基因组测序技术对来自于2008-2010年芝加哥和洛杉矶146个皮肤软组织感染病人中分离得到的USA300MRSA菌株进行数据分析，并与先前发表的USA300MRSA参考基因组（35个圣地亚哥+277个纽约）进行比较，结果显示了菌株SNPs位点及全基因组系统发育分析，从而了解了菌株的传播动力学，遗传相关性和USA300MRSA在家族内的微进化等，从而为限制社区中MRSA的传播提供了可行性策略。

研究结果：

家族中USA300 MRSA菌株持续性

146个洛杉矶和芝加哥USA300分离菌株中，每个菌株测序深度约~200×，隶属于ST8序列类型。通过对所有菌株中均存在的2,203,292-bp的核心核苷酸序列进行贝叶斯分析预估出这些菌株共有祖先的年代。图1中，蓝色分支菌株来自于芝加哥，黑色分支菌株来自于洛杉矶，红色和绿色分支分别是USA300 的TCH1516和FPR3757参考菌株。对氟喹诺酮敏感(携带grlA84S和gyrA80S)和耐氟喹诺酮（携带grlA84Y和gyrA80L）的分支分别由纵轴的绿色和红色区分。箭头处表示具有grlA84F和gyrA80L基因型的单个菌株。研究者还发现USA300菌株最近的共有祖先的预估年代为1993年，而这也与MRSA菌株在美国社区疾病传播发生的年代相一致。此外，还发现抗氟喹诺酮药性出现在1995年。

图1  146株USA300菌株核心基因组的贝叶斯分析结果

USA300泛基因组的持续性改变

通过将146株USA300菌株序列草图和NCBI上49株金黄色葡萄球菌的基因组完成图中的泛基因组组成（ 3,455个核心基因和非核心基因）进行比较，基于基因家族存在和缺失的模式发现所有的USA300菌株都聚在相同的分支上（图2）。

图2  146株USA300菌株和46株金黄色葡萄球菌的基因存在和缺失热图。红色和蓝色分别代表基因簇的存在和不存在。

图3为芝加哥家族9033的USA300分离菌株的ACME基因组缺失图，最外面两层表示USA300菌株TCH1516的参考基因组（深蓝色）；蓝色区域表示芝加哥家族9033菌株基因组概况，每个圆圈表示一个菌株，蓝色区域最外层标志性感染菌株120381含有ACME，而芝加哥家族9033的其余12个USA300分离菌株则丢失ACME精氨酸代谢移动元件；USA300参考菌株FPR3757（桔色）则存在ACME，这些结果说明在菌株上原来存在的基因岛发生了丢失（图3），可见家族中USA300菌株的基因组构型在进化过程中发生改变。

图3  BLASTmap显示芝加哥家族9033的USA300分离菌株发生了ACME基因缺失

家族中USA300菌株的聚类

对家族中USA300所有菌株，基于1629个（约130Mbp）核心蛋白质类群建树（图4），图4中每个圆圈代表了一个单独的基因型，每种颜色表示不同的家族类型。圆圈大小和具有此基因型菌株的数量成正比。家族中标号由CH（芝加哥）和LA（洛杉矶）分别表示。图中星号所标志菌株表示受感染的菌株。根据有无gylA80Y和gyrA84L基因突变（耐氟喹诺酮）将所有的USA300菌株分为CladeI和CladeII，可见菌株间明显区分为两个大支（clade I和clade II）。21个家族中有18个家族各自聚为单源类群，揭示出每个家族中均由一个单独的USA300菌株进化而来。

图4 所有USA300菌株家族遗传相关性最小化生成树图（MST）

USA300菌株氟喹诺酮耐药性的进化

为了鉴别驱使菌株聚类的遗传变异性因素，研究者使用全基因组 Weir and Cockerham’s FST分析（图5），发现芝加哥和洛杉矶分离菌株中有8个SNPs位点具有显著性差异，三个非同义包括与耐氟喹诺酮相关的gylA80Y和gyrA84L突变以及与细胞壁中主要信号传导系统相关的whiA D17E。

图5  146个USA300MRSA菌株1595个SNP位点Weir and Cockerham’s FST分析

USA300菌株氟喹诺酮耐药性不受地理位置的约束

基于来自于圣地亚哥，洛杉矶，芝加哥和纽约的核心基因组序列（约2.1Mbp）使用REALPHY软件建树。图6中对氟喹诺酮敏感的菌株由绿色分支表示，耐氟喹诺酮菌株由红色分支表示，5个耐氟喹诺酮菌株有不同的突变(grlA 80F and gyrA 84L)，用桔红色表示，3个菌株只有在grlA基因上有突变(80F)，用紫色表示。两个非USA300菌株（Newman和COL）以及两个USA300参考菌株（TCH1516和FPR3757）图中右侧由空心圆圈表示。来自于不同地区的菌株在图中右侧分别由不同颜色表示。结果显示根据有无gylA80Y和gyrA84L突变(耐氟喹诺酮)菌株们可分为两大分支。还发现耐氟喹诺酮的USA300菌株在圣地亚哥（28/35，占80%），洛杉矶（59/70，84.2%）和纽约（186/277，67.1%）广泛分布，比芝加哥地区（23/75，30.6%）相比均有显著性差异（P<0.0001），说明USA300菌株氟喹诺酮耐药性的发育进化不受地理位置的约束。

图 6  460个US300菌株（458+2株非USA300菌株）的ML树图

研究结果：

●  与先前发表的USA300MRSA参考基因组（35个圣地亚哥+277个纽约）进行比较，发现来自于圣地亚哥(SNP数目:17.6; 核苷酸多样性: Л值3.1 *10 ^-5 )和芝加哥(SNP数目:12; 核苷酸多样性: Л值3.1 *10 ^-5 )的菌株遗传变异性很低。

●  一个家族内的菌株各自聚为关系较近的单源类群，并且一个家族内的菌株是由一个共同的祖先USA300菌株发育而来。
●  根据贝叶斯进化树家族推测USA300菌株最近的共有祖先的预估年代为1993年，而USA300菌株的抗氟喹诺酮药性出现在1995年。
●  USA300菌株氟喹诺酮耐药性不受地理位置的约束，并且耐氟喹诺酮的USA300菌株在于洛杉矶和纽约传播更广。