气管插管患者的呼吸道微生物组成和动态变化

发稿时间：2016-08-04来源：天昊生物

英文题目：Composition and dynamics of the respiratory tract microbiome in intubated

patients

中文题目：气管插管患者的呼吸道微生物组成和动态变化

期刊名：Microbiome       发表时间： 2016            影响因子： 9.0

技术：16S rRNA扩增子测序（V1-V2）；

测序平台：Illumina MiSeq测序平台

样本信息：15个呼吸衰竭（需要气管插管和机械通气）受试者被纳入宾夕法尼亚大学医院的重症监护病房（MICU），分别在插管后的24小时、48小时、72小时收集样本和信息，随后持续机械通风。通过对上呼吸道口咽（OP）和深部气管（ET）分泌物进行采样。健康对照组是非气管插管的志愿者，通过口咽（OP）拭子和支气管镜下支气管肺泡灌洗（BAL）鉴定其没有潜在的肺疾病，并且此前也没有得过相关疾病。

样本取材：沿着沿气管内管的外缘对咽后壁使用一次性采样拭子采集口咽（OP）样本；沿着气管内管的内吸导管收集气管（ET）样品，首先使用5毫升无菌生理盐水冲洗内吸导管后，导管会进到远端气管，无菌生理盐水会冲洗到气管并抽吸到Lukens trap中。所有的样品在60分钟内收集好并立即储存到−80°C冰箱。

研究背景: 下呼吸道感染(LRTI)是呼吸衰竭（需要气管插管和机械通气）的主要原因。下呼吸道感染也常常发生在机械通气过程中，从而增加了气管插管患者的发病率和死亡率。本文主要想了解插管以后呼吸道菌群的动态变化，以及微生物群落结构与感染的关系。

研究结果：

受试者特征

    包括一些异质性的基础疾病和对机械通风的急性症状(表1)。4个患者有CAP/HAP记录；4个患者有抽吸记录；4个患者有临床VAP记录；2个患者在机械通气过程中有反复抽吸记录；静脉内抗生素暴露在受试者之间也各有不同（图1）。

表1：受试者特征和肺炎诊断

 

注：年龄，性别，潜在疾病，和机械通气的急性适应症对15个受试者进行了记录。Sepsis（cx negative）：无病原体脓毒症；CAP/HAP：插管后的第一个48小时内诊断为下呼吸道感染(LRTI)则归类为CAP/HAP；VAP：插管后的第一个48小时后诊断为下呼吸道感染(LRTI)则归类为VAP；Aspiration：抽吸；Subsequent；Aspiration：反复抽吸。

HCV：乙型病毒性肝炎；AML：急性髓细胞性白血病；BMT：骨髓移植；PE：肺栓塞; PEA: 无脉性电活动； ALS：肌萎缩侧索硬化症；NSCLC：非小细胞肺癌；OHS：肥胖通气不足综合征;  ESRD：晚期肾病；HD：血液透析；COPD：慢性阻塞性肺疾病；OLT：肺移植术, GVHD：移植物抗宿主病；EtOH：酒精；RSV：呼吸道合胞病毒反复抽吸。

 

图1：受试者抗生素暴露。水平灰色条形是每个受试者的持续记录。较薄的水平线表示每个受试者的静脉或口服抗生素情况。每种颜色代表不同的抗生素。时间是从登记记录前的2天到样品收集结束。星号表示受试者死于ICU。

气管插管组与健康组相比下呼吸道细菌群落多样性明显降低

健康对照组每个个体的上呼吸道（URT）和下呼吸道（LRT）的细菌群落结构很相似（图2A，B），其主要优势菌是普雷沃氏菌科，韦荣氏球菌科和链球菌科。

与健康对照组相比，气管插管者的群落结构具有更大的异质性，不同时间节点其上呼吸道和下呼吸道的细菌群落主要被某些特定的细菌类群所占据，并且与对照组不同，气管插管者在每个特定时间其上呼吸道和下呼吸道的优势菌是不同的。

图2: 插管组和健康对照组的上（A）、下（B）呼吸道科水平的细菌群落热图。

插管者的呼吸道菌群由一个单一OTU占据

     每个呼吸道样本的菌落结构比例，结果发现相比健康对照组，在插管组（上呼吸道和下呼吸道）具有最大丰度比例的OUT占据主要部分，并且Shannon 指数表明相比健康对照组，插管组的微生物多样性更低。

图3：气管插管组和健康对照组的细菌群落的各OTU的丰度比例。每个点代表一个OTU；红点代表健康对照组；蓝点代表气管插管组。

上下呼吸道的细菌群落多样性随着插管逐渐降低

图2已经发现随着时间某些气管插管者的细菌群落多样性逐渐降低。通过GEE模型计算了插管以后细菌多样性的变化，结果发现在上呼吸道和下呼吸道其细菌群落多样性Shannon指数逐渐降低（图4）。

图4: 随着时间某些气管插管者的细菌群落多样性指数变化。Healthy Control：健康对照组；Mechanical Ventilation Day 0：插管24小时内；Mechanical Ventilation Beyond Day 0：插管超过24小时；

抗生素暴露不能完全解释插管与呼吸道群落多样性降低之间的关系

    抗生素素暴露会混淆或修改呼吸道α多样性和插管之间的关系，本文调查了抗生素暴露的效应。我们把图1的抗生素暴露引入到上面的GEE模型中，结果发现引入或者不引入单个抗生素或抗生素组合没有太大影响，这说明插管与呼吸道群落多样性降低之间的关系并不能单纯归因于插管以后大剂量的抗生素暴露。

下呼吸道群落多样性降低与下呼吸道感染(LRTI)临床诊断相关

我们观察到插管48小时几例个体(个体5, 8, 10, 12, 15)的群落多样性极低，因此试图探讨这种模式与呼吸道感染临床诊断的相关性。结果在插管患者中，我们发现肺炎的临床诊断与下呼吸道的群落多样性进一步降低相关。

临床培养得到的病原体与16S rRNA测序得到的结果一致

受试者下呼吸道细菌培养鉴定到的病原菌与16S rRNA测序得到的丰度最高OTUs是一致的，但是16S rRNA测序得到的部分优势菌通过传统培养却没有得到，例如细小支原体和粪肠球菌。

总结：

l  与健康对照组上呼吸道和下呼吸道菌群高多样性相比，气管插管组在两个部位都有较低的菌群多样性。

l  插管以后，随着时间推移，菌群多样性进一步减少。

l  在每个时间点上，插管者的呼吸道菌群由单一OUT主导。

l  下呼吸道感染(LRTI)临床诊断与下呼吸道群落多样性降低相关。

l  16S rRNA测序得到的优势菌与临床细菌培养得到的结果一致，并且其鉴定到的一部分优势菌通过临床细菌培养没有得到，例如细小支原体和粪肠球菌。

l  危重患者呼吸道菌群的纵向分析为洞察和诊断下呼吸道感染的发病机制提供了有力依据。

亮点:

    文章首次研究了呼吸衰竭危重患者呼吸道微生物组成和动态变化，不但对Case/Control进行了比较，还对插管以后的呼吸道菌群进行了时间纵向分析，从而为洞察和诊断下呼吸道感染的发病机制提供了有力依据。

关于天昊：

      天昊生物采用Miseq PE250测序策略对细菌16S rDNA区/真菌ITS区/真菌18S rDNA区的双V区或多种单V区进行测序，使用低循环数扩增，保证每个样品扩增的循环数统一；采用特殊方法可有效避免系统内误差；数据质量高，有效序列Q30达到80%以上；加上最新升级的分析内容和解释详尽的结题报告，带您享受极致的微生物扩增子测序体验。