关注功能基因扩增子测序，了解功能微生物群落结构

发稿时间：2016-06-27来源：天昊生物

小题目：反硝化菌功能基因扩增子测序经典文章解读

所谓功能微生物就是在自然界中由于其功能的重要性而受到广泛关注的一类微生物，如硝化细菌、反硝化菌、氨氧化细菌、硫酸盐还原菌、固氮菌、固氮菌等。每种功能微生物在分类学上可能有很大不同，但却具有相类似的基因使其能够发挥同样的功能，因此使这些功能细菌发挥这种特定功能的基因就称为功能基因，如nxrA、nirS/nirK、amoA、dsrB、nifH、nifH。针对这些功能基因设计PCR通用引物，进行建库高通量测序，可对样本之间的功能细菌群落结构进行分析，并与每个采样点的环境因子相结合，可以同时分析环境因子与功能细菌群落结构的关系。下面就介绍一篇利用反硝化菌功能基因nirS进行高通量测序技术从而比较样本之间细菌群落结构的文章。

英文题目：Marine Oxygen-Deficient Zones Harbor Depauperate Denitrifying Communities Compared to Novel Genetic Diversity in Coastal Sediments

中文题目：与沿海沉积物中新的遗传多样性相比海洋缺氧地带具有更贫瘠的反硝化细菌群落

期刊名：Microbial ecology       发表时间： 2015.2.28            IF：2.97

单位：麻省大学生物系

技术：nirS基因测序（约650bp）

测序平台：Roche 454 FLX 测序平台

材料：

        共计21个样本，海洋缺氧区（ODZs）水样4个阿拉伯海水样AS和5个东部热带南太平洋水样ETSP；沿海沉积物样品：4个切萨皮克湾沉积物样品CB和8个盐沼地沉积物样品MP

研究背景:

        氮，作为必不可少的营养素之一，在生物地球化学循环中很复杂，因为它连接着多个水库（大气、海洋和土壤）和具有多个氧化还原状态。因此，氮循环的氮在陆地和水生生态系统中对于维持生态系统的功能是非常重要的。许多固定的氮通过污水处理系统和自然系统的反硝化作用和厌氧氨氧化两个微生物传导途径返回到大气中。固定的氮通过反硝化作用和厌氧氨氧化的去除对全球的氮循环十分重要。固定氮的损耗估计表明，65-75%海洋氮损耗发生在河口和大陆架沉积物中，其余的发生在三个主要的缺氧区（ODZs）：东部热带北部，南太平洋和阿拉伯海。在浅海沉积物中，特别是盐沼泽沉积物中，是报道最高的区域。反硝化作用似乎是最占据主导地位的损耗过程，它主要是利用微生物将硝酸盐亚硝酸盐还原成NO，N₂O和N₂的过程，实现从生态系统中移除固定的氮，控制有限氮系统的主要生产速率。氮循环过程中催化作用的关键酶，包括反硝化作用和厌氧氨氧化已经有相当多的了解。反硝化过程中使亚硝酸还原成一氧化氮的关键酶编码基因为nirS或者nirK基因。NirS基因编码细胞色素cd1亚硝酸还原酶，已经有很多报道，并且在海洋系统中已经有了比较。许多对环境多样性和微生物功能研究主要集中在16S扩增子测序，而对于特定蛋白质编码基因进行扩增子测序的研究几乎没有。本文采集了两个ODZs区水样（AS和ETSP）和沿海沉积物样品(CB和MP)，采用nirS基因高通量测序技术比较两者之间细菌群落的分布和多样性。

研究结果：

1. NirS基因Alpha多样性和稀释曲线分析

经过序列处理得到约125000条nirS序列，按95%序列相似性聚类形成OTU。所有样品共得到1815条分类OTU。沉积物MP中特异OTU很多，单个盐沼地达到529个OTU。总之，盐沼地采样点有着更高的物种多样性（Chao1和ACE预估值分别达到1239和1209）。相反，海洋缺氧区ODZ样品物种多样性很低，每个样品OTU都低于12，多样性预测值低于沉积物MP样品2-3个数量级。切萨皮克湾沉积物CB物种多样性介于两者之间。

尽管发现沉积物中有更高的多样性，但这些样品的稀释曲线却没有达到平稳状态，说明测序数据量不够，还有相当多的多样性有待于进一步采样测序。相比之下，海洋缺氧区ODZ样品稀释曲线OTU数量更少，且许多样品稀释曲线已经达到平缓期，显示了高序列覆盖度。在与硝酸盐高去除率相关的特定环境条件下，反硝化细菌多样性的减少显示仅有极少数反硝化细菌在ODZs区域起移除固定氮的作用。沉积物中物种丰富度和系统发育高度多样性这一现象，可能是由于沿海生态系统是海洋和陆源输入的最终受体，因此它有着更多栖息的微生物从而使微生物的整体多样性得到提高。

                                             

表1：取样点位置信息，观测到的OTU数量，两个菌群丰度指数（Chao1 and Ace）和菌群多样性指数（Shannon）

图1：海洋沉积物（左图）和两个海洋缺氧区（右图）样品nirS基因序列的稀释性曲线

2.  NirS基因系统发育分析

通过对nirS基因的OTU进行系统进化分析，总共得到13个分支，大多数属于4个大的分支（5,7,8和13）。1815个nirS OTU中只有35个OTU和纯培养的代表序列相似度大于85%。平均的序列相似度为78+3.2%，这表明产生了许多新的反硝化微生物。

对于每个分支，把每个栖息地的OTU的相对丰度通过画图表示出来。主要OTU序列只出现在沿海沉积物中，且只有分支13的OTUs与可培养的alpha变形菌序列相似度大于85%。

分支8在盐沼地沉积物MP样品中丰度最高的OTU（OUT 1796, 占沼泽nirS 序列的15 %），与Gamma变形菌相似度高。其次，盐沼地沉积物中丰度次高的OTU（OUT 1800, 占沼泽nirS 序列的14%），分布在分支11中，这个OTU与beta变形菌中的Brachymonas denitrificans序列相似度为80%，数据显示变形菌纲可能在盐沼地沉积物去除固定氮方面发挥着重要作用。

尽管切萨皮克湾沉积物CB样品也采自于沿海沉积物，但切萨皮克湾沉积物CB样品细菌群落的系统发育结构与盐沼地沉积物MP样品细菌群落有很大的区别，CB样品中有40%的序列隶属于分支7的亚支，没有可匹配于纯培养代表序列的序列。

海洋缺氧区ODZs样品的nirS序列系统发育结构和沿海沉积物相比显著变窄。阿拉伯海（AS）水样中，有99%的序列属于5个OTU类群（OTU1650/1570/1483/1425/1453），在ETSP水样中，99%序列属于4个OTU（OTU1570/1520/1487/1333）。属于分支12最远分支的OTU1570是ODZs区域丰度最高的OTU，它在阿拉伯海AS和热带东太平洋ETSP样品中分别占38%和59%，它与厌氧氨氧化细菌Scalinduas属nirS序列相似度为92%。其余的ODZs区优势OUT，如OTU1650和OTU1520分别位于分支7和8，分别在AS和ETSP样品中占42%和36%。这些序列与可培养代表序列的相似度低于75%，系统发育结构更加证明了海洋缺氧区ODZs和沿海沉积物反硝化细菌群落相比是十分贫瘠的。

图2. NirS基因的OTU系统发育树。Marsh sediments：沼泽沉积物；Estuarine sediments：河口沉积物；Eastern Tropical S.Pacific ODZ : 热带东太平洋;  Arabian Sea ODZ：阿拉伯海

3. NirS基因Beta多样性分析

基于weighted UniFrac的热图显示样品可以聚类于两种，一类是ODZs区域的大部分样品，一类是所有的沉积物样品和两个来自于ODZ区域的ETSP3和AS1，表明不同栖息地的反硝化细菌群落之间有着显著差异，这个结果也通过Adonis分析结果证明。

图3. 对nirS序列的weighted UniFrac热图分析。UniFrac 度量越低，就和被比较样本的群落结构越相似。方框中的数字代表是UniFrac 度量。ETSP：东部热带南太平洋地区；AS：阿拉伯海；CB：切萨皮克湾；MP： Sippewissett沼泽区

基于weighted UniFrac距离的PCoA分析进一步证实了热图的聚类结果。一轴和二轴分别解释了67%和11%的群落差异。此外可以看出8个盐沼地样品（MP）和ODZs的样品随着x轴分布分别聚类，CB样品沿着y轴分布聚在一簇。ODZs区样品形成一个主要类群，包括AS区3个样品和ETSP区3个样品。

图4：基于weighted UniFrac距离的PCoA分析。AS：阿拉伯海； ETSP：东部热带南太平洋；CB：切萨皮克湾；MP：Sippewissett沼泽区；

为了进一步研究ODZs区反硝化细菌的群落结构，研究者分析了每个采样点的环境因子与反硝化细菌群落结构的关系。CCA图显示AS和ETSP样品分布不同，一轴和二轴解释度分别为35%和21%。ETSP样品聚类更明显。发现温度对AS和ETSP反硝化细菌群落变异的影响最大。在CCA图中，每个样品后面的百分数显示了每个样品中这条序列占所有序列的百分比。发现ETSP5样品中这条序列百分数更高。还发现亚硝酸盐浓度和深度也与群落变异相关，揭示了在任何给定时间内厌氧氨氧化或者反硝化中氮损耗过程是动态的。

图5：海洋缺氧区的CCA分析。每个样品后面的百分数显示了每个样品中这条序列占所有序列的百分比。

总体评价：

研究者共得到超过12500条nirS基因序列，揭示了大量的遗传多样性，包括1815个特别类群，绝大多数是不可培养的细菌类群。这些结果强调我们对生物地球化学循环途径中潜在关键代谢基因多样性的了解甚少。

和沿海沉积物中nirS基因多样性相比，ODZs的基因多样性显著降低。海洋沉积物中有1776特别细菌类群，却没有一个单独的反硝化细菌成为竞争优势种，相对应的，两个ODZs样品中只有39个独特细菌类群，99%的序列隶属于5个或者更少的物种。ODZs样品中的主要序列与厌氧氨氧化细菌Scalinduas属nirS序列相似度为92%，这个序列是ODZs区域丰度最高的OTU，它在AS和ETSP样品中分别占38%和59%，而这个序列在海洋沉积物中几乎没有。本研究为阿拉伯海和热带南太平洋地区反硝化途径提供了强有力的遗传支持。

目前，天昊生物在功能微生物功能基因的扩增子测序方向有丰富经验，实验流程稳定成熟，例如固氮基因nifH，反硝化关键基因nirS等，其他功能基因欢迎电话垂询：400-065-6886